W tym filmie pokazujemy zastosowanie optycznej koherentnej tomografii w domenie spektralnej (SD-OCT) do obrazowania warstw siatkówki i oceny zmian strukturalnych w genetycznie zmodyfikowanym modelu myszy z neuropatią nerwu wzrokowego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie in vivo siatkówki myszy za pomocą optycznej koherentnej tomografii
1.4K wyświetleń
⸱
29 maja 2025
W tym artykule
Streszczenie
Protokół
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie myszy
- Rozszerzenie i unieruchomienie oczu
- Przynajmniej 15 minut przed pozyskaniem danych wkrać 10% kropli do oczu fenylefryny do oczu myszy, usuń nadmiar, i wkraplania 0,5% tropikamidowych kropli do oczu.
UWAGA: Pierwszą dylatację można wykonać od razu dla wszystkich myszy, które będą testowane podczas sesji. Upewnij się, że płyny mają temperaturę pokojową. - Natychmiast po wywołaniu znieczulenia ogólnego (krok 1.2) należy podać 0,4% krople do oczu z chlorowodorkiem oksybuprokainy, utrzymując je na miejscu przez 3 sekundy w celu znieczulenia i unieruchomienia oczu. Następnie zetrzyj krople i powtórz wkraplanie 10% fenylefryny i 0,5% tropikamidu, aby upewnić się, że oczy są dobrze rozszerzone.
UWAGA: Upewnij się, że płyny mają temperaturę pokojową i że mysz nie połyka oksybuprokainy.
- Przynajmniej 15 minut przed pozyskaniem danych wkrać 10% kropli do oczu fenylefryny do oczu myszy, usuń nadmiar, i wkraplania 0,5% tropikamidowych kropli do oczu.
- Znieczulenie ogólne
- Przygotuj znieczulający roztwór ketaminy (20 mg/ml) i ksylazyny (1,17 mg/ml) w soli fizjologicznej. Przechowywać w temperaturze 4 °C maksymalnie 2 tygodnie.
- Około 5 minut przed badaniem wstrzyknąć dootrzewnowo 5 - 10 μl roztworu znieczulającego na 1 g masy ciała, w zależności od wieku i wielkości myszy.
UWAGA: Młode i/lub chude myszy potrzebują mniej znieczulenia, potrzebują mniej czasu na znieczulenie, ale także szybciej się budzą. Tutaj 8 μl/g (160 mg/kg ketaminy, 9,33 mg/kg ksylazyny). - Opcjonalnie nasmaruj oczy lepkimi kroplami do oczu lub żelem okulistycznym, aby uniknąć wysuszenia rogówki.
2. Pozycjonowanie myszy
- Nasmaruj oczy lepkimi kroplami do oczu na bazie glikolu, aby zapewnić nawilżenie rogówki.
UWAGA: Jeśli oczy wydają się suche podczas badania, ponownie nałóż krople do oczu. - Owiń mysz w arkusz gazy chirurgicznej, aby utrzymać ją w cieple.
- Za pomocą gąbki lub bawełnianego knota nałóż cienką warstwę żelu okulistycznego z 0,3% hypromelozą na każde oko, aby zminimalizować załamanie światła, uniknąć zmętnienia i zapewnić nawilżenie rogówki. Robiąc to, odsuń rzęsy i wąsy na bok.
- Umieść mysz w kasecie, z głową wyprostowaną i skierowaną do przodu.
- Delikatnie otwórz zacisk pręta do gryzienia i umieść pręt w ustach; Użyj opaski na nos, aby zabezpieczyć pozycję.
UWAGA: Upewnij się, że belka gryząca znajduje się na środku kasety. - Umieść bawełnianą rolkę pod prawą (lewą) stroną, jeśli badane jest prawe (lewe) oko.
- Trzymając przypinaną końcówkę celowniczą na soczewce specyficznej dla myszy, przyłóż ją do oka, obracając śrubę Z-translator w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara.
- Obracając i obracając kasetę oraz obracając listwę zgryzową i śruby X-translator, ustaw wstępnie pozycję myszy; Celem jest, aby prawe oko patrzyło bezpośrednio w soczewkę, a tym samym wyrównało osie optyczne oczu i soczewki.
UWAGA: Jeśli mysz jest zbyt wysoko lub zbyt nisko, należy najpierw użyć śruby Y-translator. - Wybierz pierwszy skan w "Badaniu", kliknij "Rozpocznij celowanie" i dokonaj dalszych ręcznych korekt obrazowania siatkówki.
- Za pomocą śruby Z-translator przesuń siatkówkę pionowo na lewym panelu (Rysunek 1, Wyrównanie poziome B-scan) i poziomo na prawym panelu (Rysunek 1, Wyrównanie w pionie B-scan).
- Obróć kasetę, aby przesunąć ONH na środek prawego panelu, przesuwając ONH w górę lub w dół. Użyj śruby pręta gryzowego, aby wyprostować siatkówkę na prawym panelu. Obróć kasetę, aby ustawić ONH na środku lewego panelu.
- Użyj śruby X-translator, aby wypoziomować siatkówkę na lewym panelu. Mając na uwadze główną funkcję każdego modulatora, należy dodatkowo dostosować położenie siatkówki, aby scentralizować ONH.
UWAGA: Użyj śruby Y-translator, aby przesunąć ONH w górę iw dół na prawym panelu, jeśli to konieczne. Pozycja może zostać poprawiona w dowolnym momencie między skanowaniami.
3. Obrazowanie SD-OCT ONH i siatkówki
- Po uzyskaniu ustawień kliknij "Rozpocznij migawkę", aby rozpocząć skanowanie SD-OCT.
- Jeśli obrazowanie 3D nie jest wymagane, odznacz opcję OCU.
- Zapisz skan i raport.
- Kontynuuj kolejne skanowania.
- Aby zobrazować drugie oko, po schowaniu soczewki należy odpowiednio obrócić kasetę i powtórzyć kroki 2.6 - 3.3.
4. Zakończenie akwizycji
- Gdy akwizycja zostanie zakończona, wyjmij mysz z kasety, nałóż żel okulistyczny z 0,3% hypromelozą na każde oko i umieść mysz na płycie grzewczej, aby się obudzić.
- Po ostatnim pobraniu zamknij oprogramowanie i wyłącz komputer oraz maszynę OCT (przycisk zasilania).
- Wyczyść kasetę środkiem dezynfekującym.
5. Analiza
- Do pomiaru grubości warstwy siatkówki należy skorzystać z oprogramowania do automatycznej segmentacji dostarczonego przez producenta.
- Kliknij "Pacjent", wybierz żądany "Egzamin" z listy i kliknij opcję "Przegląd egzaminu".
- Załaduj żądane dane OCT do oprogramowania OCT, klikając prawym przyciskiem myszy ikonę folderu w żądanym skanowaniu.
- Kliknij prawym przyciskiem myszy B-scan; skonfigurować suwmiarki, włączając do 10 suwmiarek pomiarowych; i wprowadź ich nazwy, kąty i kolory.
- Wybór żądanej suwmiarki poprzez kliknięcie prawym przyciskiem myszy B-scan; Umieść go odpowiednio na siatkówce w celu pomiaru.
UWAGA: W przypadku skanów wyśrodkowanych na ONH ustaw 5 suwmiarek po każdej stronie, w równej odległości od siebie. W przypadku analizy obwodowo-brodawkowej upewnij się, że suwmiarka nie jest umieszczona zbyt daleko od ONH. W przypadku skanowania promieniowego przeanalizuj 10 zdjęć na skan, które zostały wybrane przez oprogramowanie OCT. Ich numery znajdują się w folderze "Raporty". - Zapisz wyniki do analizy w arkuszu kalkulacyjnym, klikając prawym przyciskiem myszy B-scan i klikając "Zapisz wyniki".
UWAGA: Wyniki można znaleźć w tym samym folderze, co dane skanowania.
- Alternatywnie można użyć domowego makra suwmiarki "MRI Retina Tool", opracowanego dla programu do przetwarzania obrazów o otwartym kodzie źródłowym (patrz tabela materiałów).
- Upewnij się, że makra "MRI Retina Tool" i "Modify Polygon Section Tool" są aktywne. Załaduj obraz. Kliknij przycisk m, aby rozpocząć pomiar.
UWAGA: Makro automatycznie tworzy jedną kasetę pomiarową o długości 0,2 mm po obu stronach ONH. Każda kaseta zawiera 5 punktów pomiarowych, które pełnią funkcję suwmiarki. Ich pozycja boczna jest niezmienna i jest dostosowana do okołobrodawki w skanach promieniowych. Pozycja pozioma kaset jest wstępnie zdefiniowana do pomiaru grubości RNFL/GCL, ale można ją łatwo zmodyfikować, aby zamiast tego zmierzyć warstwę zespoloną GC. Jeśli jakość skanowania jest niska, należy dostosować pozycję poziomą lub wykluczyć obraz z analizy. - Aby dostosować się w poziomie, kliknij przycisk e. W nowo otwartym oknie "ROI Manager" wybierz pierwszą kasetę.
- Kliknij niebieski przycisk wielokąta i dostosuj położenie pierwszej kasety, klikając obramowania mierzonej warstwy na obrazie.
- Powtórz dla drugiej kasety, najpierw wybierając ją w oknie "Menedżer ROI", a następnie klikając odpowiedni obraz. Kliknij przycisk r, aby ponownie zmierzyć. Wyświetl wyniki w oknie "Pomiary".
UWAGA: Wyniki można w każdej chwili skopiować do arkusza kalkulacyjnego. Zawierają one następujące wartości dla prawej kasety (r), lewej kasety (l) i sumy: Intden - gęstość zintegrowana w kasecie; Powierzchnia: obszar pomiaru, w mm2; Len: długość zacisku w kasecie, w mm; Średnia: średnie natężenie sygnału w kasecie; i Std: błąd standardowy średniego natężenia sygnału. - Przejdź do następnego obrazu.
- Dalej analizuj dane w arkuszu kalkulacyjnym.
UWAGA: Aby znaleźć średnią grubość warstwy, weź dziesięć wartości Len.
- Upewnij się, że makra "MRI Retina Tool" i "Modify Polygon Section Tool" są aktywne. Załaduj obraz. Kliknij przycisk m, aby rozpocząć pomiar.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Mice | |||
| Opa1delTTAG mouse< | Myszy knock-in Opa1 z mutacją OPA1 c.2708_2711delTTAG na tle C57Bl6/J | ||
| Sprzęt | |||
| System obrazowania EnVisu R2200 SD-OCT | Bioptigen, Leica Microsystems, Niemcy | - | System tomografii koherentnej optycznej w domenie spektralnej |
| Oprogramowanie systemu obrazowania EnVisu R2200 SD-OCT | Bioptigen, Leica Microsystems, Niemcy | - | Oprogramowanie do akwizycji i analizy OCT |
| ImageJ 1.48v | Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA | - | Oprogramowanie do analizy, wymaga pobrania i zainstalowania dwóch domowych makr: http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool |
| Samoregulująca płyta grzewcza | Bioseb, Francja< | Ochrona przed hipotermią | |
| Zaopatrzenie | |||
| Poduszki z gazy 3"x3" | Curad, Stany Zjednoczone | CUR20434ERB | Ochrona przed hipotermią |
| Aplikator z bawełnianą końcówką z podwójnym końcem | Essence of Beauty, CVS Health Corporation, USA | - | Aplikacja żelu |
| Cotton Twists | CentraVet, Francja | T.7979C.CS | Mouse positioning |
| Odczynniki i leki | |||
| Néosynéphrine Faure 10% | Laboratoires Europhtha, Monako | - | Rozszerzenie oczu |
| Mydriaticum 0,5% | Laboratoires Théa, Francja | 3397908 | Rozszerzenie oczu |
| Cebesine 0,4% | Laboratoire Chauvin, Bausch&Lomb, Francja | 3192342 | Znieczulenie miejscowe |
| Imalgene 1000 | Merial, Francja/CentraVet, Francja | IMA004 | Znieczulenie ogólne |
| Rompun | Bayer Healthcare, Niemcy/CentraVet, Francja | ROM001 | Znieczulenie ogólne, analgezja, rozluźnienie mięśni |
| NaCl 0,9% | Laboratoire Osalia, Francja | 103697114 | Fizjologiczne serum |
| Systene Ultra | Alcon, Novartis, Stany Zjednoczone | - | Nawilżenie oczu |
| GenTeal' | Alcon, Novartis, Stany Zjednoczone | - | Żel okulistyczny minimalizujący załamanie światła i zmętnienia |
| Aniospray Surf 29 | Laboratoires Anios, Francja | 59844 | Środek dezynfekujący |
