$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.
1. Obrazowanie poklatkowe
- } Konfiguracja mikroskopu
- Ustaw komorę klimatyczną umieszczoną na stoliku odwróconego mikroskopu konfokalnego na temperaturę 37 °C i 5% atmosfery dwutlenku węgla. Użyj detektora hybrydowego, aby zmniejszyć intensywność lasera i poprawić żywotność komórek. Do szczegółowej analizy należy użyć suchego obiektywu o bardzo dużej odległości roboczej 40X i aperturze numerycznej 0,6 lub większej.
Uwaga: Wszystkie elementy mikroskopu muszą być wstępnie podgrzane do 37 °C przez 2 - 3 godziny przed obrazowaniem, aby zapewnić stabilną ostrość podczas procesu obrazowania.
- Obrazowanie wycinków
- Wybierz wycinek mózgu do obrazowania z 6-dołkowej płytki zawierającej wkładki membranowe za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego.
Uwaga: Unikaj przedłużonego czasu ekspozycji na światło ultrafioletowe, ponieważ może to spowodować fotouszkodzenie komórek.
UWAGA: Wybierz wycinek z jasnymi pojedynczymi neuronami w górnej SVZ (strefa podkomorowa) migrującymi promieniście w kierunku powierzchni wycinka. Drobne procesy fluorescencyjne promienistych komórek glejowych, które obejmują całą CP (płytkę korową) wskazują na nienaruszone promieniste rusztowanie glejowe, które jest wykorzystywane przez promieniście migrujące neurony korowe. - Za pomocą kleszczy przenieś wkładkę membranową z plastrem, który został wybrany do obrazowania poklatkowego, do naczynia ze szklanym dnem o średnicy 50 mm zawierającego 2 ml pożywki do hodowli plastrów. Umieść naczynie w komorze klimatycznej mikroskopu konfokalnego.
- Ustaw rozdzielczość na 512 na 512 pikseli i zwiększ prędkość skanowania z 400 Hz do 700 Hz, aby zwiększyć liczbę klatek na sekundę odpowiednio z około 1,4 do około 2,5 klatki na sekundę. Uśredniaj nie więcej niż dwa razy. Zdefiniuj stos z przechodzący przez obszar elektroporowany (zwykle 400-100 μm) z rozmiarem kroku 1,5 μm. Łącznie ustawienia te pozwalają na uzyskanie wystarczającej rozdzielczości i jasności obrazu przy jednoczesnym utrzymaniu niskiego poziomu fotouszkodzeń podczas akwizycji. Rozpocznij serię poklatkową, wykonując z-stack co 30 minut.
UWAGA: Długotrwała ekspozycja wycinka na światło laserowe wywoła fotouszkodzenia, zmniejszając żywotność komórek. Dostosuj odpowiednio czas ekspozycji na światło lasera. - Analizuj serie poklatkowe za pomocą oprogramowania ImageJ (https://imagej.nih.gov/iij/) lub jego odpowiednika.