Obrazowanie poklatkowe migracji radialnej neuronów korowych w transdukowanych wycinkach mózgu embrionalnego myszy

Streszczenie

Źródło: Wiegreffe, C., et. al., Poklatkowe obrazowanie konfokalne migrujących neuronów w organotypowej kulturze warstwowej embrionalnego mózgu myszy przy użyciu {{}}W macicy elektroporacji. J. Vis. exp.{{TAG_ 44}} (2017)

Ten film przedstawia poklatkową mikroskopię konfokalną w celu obserwacji radialnej migracji neuronów korowych ze strefy podkomorowej do płytki korowej za pomocą promieniowych rusztowań glejowych w transdukowanych wycinkach mózgu myszy embrionalnych.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Obrazowanie poklatkowe

1. } Konfiguracja mikroskopu
   1. Ustaw komorę klimatyczną umieszczoną na stoliku odwróconego mikroskopu konfokalnego na temperaturę 37 °C i 5% atmosfery dwutlenku węgla. Użyj detektora hybrydowego, aby zmniejszyć intensywność lasera i poprawić żywotność komórek. Do szczegółowej analizy należy użyć suchego obiektywu o bardzo dużej odległości roboczej 40X i aperturze numerycznej 0,6 lub większej.
      Uwaga: Wszystkie elementy mikroskopu muszą być wstępnie podgrzane do 37 °C przez 2 - 3 godziny przed obrazowaniem, aby zapewnić stabilną ostrość podczas procesu obrazowania.
2. Obrazowanie wycinków
   1. Wybierz wycinek mózgu do obrazowania z 6-dołkowej płytki zawierającej wkładki membranowe za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego.
      Uwaga: Unikaj przedłużonego czasu ekspozycji na światło ultrafioletowe, ponieważ może to spowodować fotouszkodzenie komórek.
      UWAGA: Wybierz wycinek z jasnymi pojedynczymi neuronami w górnej SVZ (strefa podkomorowa) migrującymi promieniście w kierunku powierzchni wycinka. Drobne procesy fluorescencyjne promienistych komórek glejowych, które obejmują całą CP (płytkę korową) wskazują na nienaruszone promieniste rusztowanie glejowe, które jest wykorzystywane przez promieniście migrujące neurony korowe.
   2. Za pomocą kleszczy przenieś wkładkę membranową z plastrem, który został wybrany do obrazowania poklatkowego, do naczynia ze szklanym dnem o średnicy 50 mm zawierającego 2 ml pożywki do hodowli plastrów. Umieść naczynie w komorze klimatycznej mikroskopu konfokalnego.
   3. Ustaw rozdzielczość na 512 na 512 pikseli i zwiększ prędkość skanowania z 400 Hz do 700 Hz, aby zwiększyć liczbę klatek na sekundę odpowiednio z około 1,4 do około 2,5 klatki na sekundę. Uśredniaj nie więcej niż dwa razy. Zdefiniuj stos z przechodzący przez obszar elektroporowany (zwykle 400-100 μm) z rozmiarem kroku 1,5 μm. Łącznie ustawienia te pozwalają na uzyskanie wystarczającej rozdzielczości i jasności obrazu przy jednoczesnym utrzymaniu niskiego poziomu fotouszkodzeń podczas akwizycji. Rozpocznij serię poklatkową, wykonując z-stack co 30 minut.
      UWAGA: Długotrwała ekspozycja wycinka na światło laserowe wywoła fotouszkodzenia, zmniejszając żywotność komórek. Dostosuj odpowiednio czas ekspozycji na światło lasera.
   4. Analizuj serie poklatkowe za pomocą oprogramowania ImageJ (https://imagej.nih.gov/iij/) lub jego odpowiednika.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
6-well plate	Corning	351146
Mikroskop hodowli tkanek z odwróconą fluorescencją	Leica	DM IL LED
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy	Leica	TCS SP5II
Detektor hybrydowy	Leica	HyD
Obiektywny, 40x/0,60 NA	Leica	11506201
System kontroli temperatury mikroskopu	Usługi obrazowania życia	Cube, Brick & Box
Wkładka do hodowli komórkowej	Millipore	PICM0RG50
Microgrinder	Narishige	EG-45	Użyj kąta 38° do fazowania
Microinjector	Parker Hannifin	052-0500-900	Picospritzer III
Pęseta z 5 mm platynowymi elektrodami krążkowymi	Sonidel	CUY650P5
Ściągacz do mikropipet	Instrument Suttera	P-97
Filament Box	Instrument Sutter	FB255B	2,5 mm x 2,5 mm
Szpatułka do mikrołyżki	VWR	231-0191	185 mm x 5 mm
Naczynie ze szklanym dnem, 50 mm	World Precision Instruments	FD5040-100