Selektywna ablacja laserowa pojedynczego neuronu u larwy danio pręgowanego przy użyciu mikroskopu konfokalnego

Streszczenie

Źródło: Morsch, M., , Wywoływanie stresu i śmierci komórki za pomocą konwencjonalnej laserowej mikroskopii konfokalnej UV. J. Vis. Exp. (2017)

Protokół

1. Przygotuj roztwory do osadzania danio pręgowanego w agarozie.
   1. Przygotować roztwór znieczulający, dodając kroplami 4 g/l MS222 (roztwór podstawowy trikainy, pH 7,0) do szalki Petriego zawierającej wodę jajeczną. Dawka 50 mg/L jest zalecanym punktem wyjścia (Rysunek 1A).
   2. Przygotuj zapas niskotopliwej agarozy (0,8 - 1,5%) w wodzie jajecznej i podziel go na porcje do 1,5 ml probówek do mikrowirówek. Umieścić podwielokrotność w podgrzanym bloku grzewczym (38 - 40 °C) i pozostawić do osiągnięcia ustawionej temperatury (~ 30 min; Rysunek 1B).
   3. Opcjonalnie: W przypadku obrazowania długoterminowego (> 4 godziny) przygotuj mały okrąg agarozowy na szalce Petriego o średnicy 35 mm ze szklanym dnem i pozwól mu zastygnąć.
      UWAGA: Ten dodatkowy krok skutecznie pozwolił uniknąć jakiegokolwiek ruchu całej kropli agarozy z danio pręgowanym w dłuższych ramach czasowych.
      1. W tym celu umieść ~ 300 μl agarozy wzdłuż wewnętrznego okręgu naczynia ze szklanym dnem, aby przygotować okrąg w kształcie pączka z małym otworem pośrodku, w którym należy umieścić rybę (krok 1.5.3).
2. Zamontuj danio pręgowanego w agarozie do mikroskopii.
   1. Wybierz 1 - 3 wstępnie przesiane ryby do ablacji i znieczul larwy, przenosząc je (za pomocą pipety transferowej) do naczynia z roztworem znieczulającym (krok 1.4.1; Rysunek 1C; około 5 min).
      UWAGA: Ryby są znieczulane, gdy wykazują płytki ruch operkularny i zmniejszone tętno i nie wykazują już wywołanej dotykiem reakcji ucieczki (TEER; niemożność odpłynięcia po delikatnym dotknięciu ogona szczotką). Należy zapewnić odpowiednie znieczulenie w celu etycznego traktowania ryb i zapobiec drgawkom po przeniesieniu do agarozy lub wystawieniu na działanie światła fluorescencyjnego.
   2. Po potwierdzeniu znieczulenia należy zassać larwę za pomocą regulowanej pipety (z końcówką odcinającą 200 μL ustawioną na ~ 30 μL) i pozwolić jej opaść na dno końcówki. Przenieś larwę do podgrzanej agarozy (krok 1.4.2), uwalniając kroplę płynu z larwą do agarozy (staraj się zminimalizować ilość wody jajecznej dostającej się do agarozy; Rysunek 1D).
   3. Zassać rybę otoczoną agarozą. Szybko przelej go do wcześniej przygotowanego naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 mm.
   4. Użyj mikroskopu preparacyjnego i standardowego pędzla (długa wkładka, rozmiar 1), aby ustawić zwierzę w agarozie z boku (głowa w lewo) tak, aby ciało i ogon były płaskie (Rysunek 1E). Jeśli pracujesz z wieloma rybami, wyrównaj wszystkie ryby w naczyniu tak, aby można je było później łatwo zlokalizować za pomocą mikroskopu konfokalnego.
      UWAGA: Szybko wykonaj tę procedurę pozycjonowania i wyrównywania (może to wymagać trochę wprawy, ponieważ agaroza zaczyna twardnieć natychmiast po wystawieniu na działanie niższych temperatur).
   5. Pozostaw rybę zanurzoną w agarozie na 10 - 15 minut, aż agaroza mocno się zetnie. Ostrożnie uzupełnij 35-milimetrową szalkę Petriego ~ 2 ml wody jajecznej zawierającej trikainę (Rysunek 1F).

2. Ustaw mikroskop konfokalny i parametry obrazowania

1. Umieść szalkę Petriego z osadzoną larwą na stoliku mikroskopu konfokalnego i skup się na grzbietowej stronie rdzenia kręgowego zwierzęcia (używając jasnego pola). Zbadaj zwierzę w odpowiednim powiększeniu (40X) i ustawieniu fluorescencyjnym oraz zwizualizuj strukturę zainteresowania (e.g.g., intensywności fluorescencji znakowanych neuronów lub ruchu mikrogleju), aby potwierdzić, że wszystkie parametry obrazowania są potrzebne do późniejszej ablacji (Rysunek 2). Rutynowo używamy obiektywu 40X do wykonywania naszych badań poklatkowych.
2. Opcjonalnie: Aby przeprowadzić badanie poklatkowe trwające kilka godzin, zaleca się zarejestrowanie jednego lub kilku punktów czasowych przed ablacją w celu ustalenia niezakłóconej odpowiedzi fizjologicznej komórki i jej otoczenia (e.g., ruchu mikrogleju w celu ustalenia wyjściowej prędkości i ruchliwości).
3. Określ grubość struktury będącej przedmiotem zainteresowania dla ablacji laserem UV.
   1. Korzystając z dysku z, sprawdź górną i dolną część interesującej nas struktury (e.g., soma komórki), ręcznie ustawiając ostrość w górę iw dół. Zanotuj płaszczyznę z, która zostanie usunięta (e.g., środek komórki).
      UWAGA: Z doświadczenia wynika, że ta metoda była najbardziej skuteczna, celując w neurony rdzenia kręgowego, które były jasno oznaczone (wysoki stosunek sygnału do szumu, który umożliwia łatwą wizualizację poklatkową po ablacji; e.g., Rysunek 4) i przez ablację środka somy komórkowej. Fluorescencja jądra komórkowego może być korzystna, aby zapewnić prawidłowe celowanie i wysoką skuteczność ablacji.

3. Wykonaj celowaną ablację laserową pojedynczych komórek w rdzeniu kręgowym danio pręgowanego

UWAGA: Do tego podejścia do ablacji i wizualizacji użyto mikroskopu konfokalnego (Leica SP5). Procedura ablacji przy użyciu diody 405 nm do niszczenia specyficznego dla komórki jest szczegółowo opisana w oprogramowaniu (Leica Application Suite, v2.7.3.9723). Jednak każdy konwencjonalny mikroskop konfokalny, który jest wyposażony w laser 405 nm i FRAP (odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu) lub moduł wybielający, pozwoli na wykonywanie tych samych manipulacji komórkami, ale potencjalnie z nieco innymi ustawieniami, parametrami i nazwami.

1. Uruchom kreatora FRAP, klikając menu rozwijane u góry menu oprogramowania (Rysunek 3A, 1 i 2). Obserwuj nowe okno z różnymi krokami, które umożliwia ustawienie określonych parametrów dla ablacji laserowej (Rysunek 3B, 3).
2. Określ parametry obrazu dla podejścia ablacyjnego, wybierając format, prędkość skanowania (Rysunek 3B, 4) i uśrednianie (Rysunek 3B, 5). Najbardziej odpowiedni był format obrazu 1 024 x 1 024 przy prędkości skanowania 400 Hz i średniej liniowej 4.
   UWAGA: Generalnie nie ma potrzeby zmiany detekcji spektralnej (np. parametrów wzbudzenia czy emisji), ponieważ zostały one określone w poprzedniej akwizycji.
   1. Jeśli płaszczyzna Z do ablacji nie została jeszcze wybrana (zgodnie z opisem w kroku 2.4.), naciśnij przycisk "Na żywo" i ustaw ostrość na próbce, aż struktura fluorescencyjna lub żądana płaszczyzna z, która ma zostać poddana ablacji, będzie ostra.
3. Po ustawieniu ogólnych parametrów obrazu przejdź do kroku "Wybielacz" (Rysunek 3C, 6), aby kontrolować określone składniki ablacji.
   UWAGA: Kombinacja intensywności lasera (Rysunek 3C, 8), prędkość skanowania i uśrednianie, które zostało ustawione w kroku 3.2 (Rysunek 3B, 4 i 5), a także liczbę powtórzeń, które zostaną ustawione w kroku 3.5 (Rysunek 3E, 12), określi całkowity czas przebywania lasera UV przy ROI, a tym samym wydajność wybielania.
   1. Włącz laser 405 nm, aktywując go do procedury wybielania (Rysunek 3C, 8).
      UWAGA: Większość sukcesów z wyżej wymienionymi ustawieniami została osiągnięta przy intensywności lasera 405 nm między 60 a 80% w naszej eksperymentalnej konfiguracji. Należy pamiętać, że ta moc wyjściowa lasera jest specyficzna dla danego instrumentu i będzie się różnić w zależności od konfiguracji konfokalnej.
   2. Użyj opcji "powiększ" (Rysunek 3C, 7), aby zmaksymalizować intensywność wybielania przy wybranym ROI, zmniejszając pole skanowania, maksymalizując w ten sposób czas przebywania. Alternatywnie użyj opcji "Punkt wybielania" w wybranym oprogramowaniu do tego procesu.
4. Wybierz jeden lub wiele ROI (Rysunek 3D, 10) do ablacji za pomocą dowolnego narzędzia do rysowania w oknie akwizycji obrazu (Rysunek 3D, 9). Celuj na przykład w wzgórze aksonu za pomocą okrągłego narzędzia do rysowania o średnicy około 4 - 8 μm.
   UWAGA: Obszar ablacji można regulować od pojedynczego piksela do większego obszaru, w zależności od zastosowania.
5. Po ustaleniu ROI wybierz przycisk "Przebieg czasowy" (Rysunek 3E, 11) i potwierdź liczbę cykli, w których ROI zostaną zeskanowane/ablowane (Rysunek 3E, 12). Wybierz odpowiednio klatki "Pre-Bleach" i "Post-Bleach", aby umożliwić przegląd całego obrazu tuż przed i bezpośrednio po procesie wybielania.
6. Po ustaleniu wszystkich niezbędnych parametrów ablacji naciśnij "Uruchom eksperyment" (Rysunek 3E, 13) i monitoruj skuteczność ablacji.
   UWAGA: W naszej konfiguracji FRAP pojedynczy obraz zostanie wykonany przed i po cyklu FRAP z odpowiednim wzbudzeniem laserowym (e.g., wzbudzenie 488 nm dla komórek wykazujących ekspresję EGFP). Te zdjęcia przed i po ablacji pozwalają szybko ocenić, jak zadowalająco wybielono zwrot z inwestycji i jak skuteczne były wybrane parametry ablacji.
7. Powtórz proces, dostosowując intensywność lasera (Rysunek 3C, 8), prędkość skanowania i uśrednianie (Rysunek 3B, 4 i 5) i powtórzenia (Rysunek 3E, 12) w przypadku, gdy wybrany ROI nadal wykazuje wysoką intensywność fluorescencji po zakończeniu cyklu FRAP.

Wyniki

Materiały