Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Kalibracja PET/CT i konfiguracja przepływu pracy (6 dni po operacji dMCAO)
- Utwórz przepływ pracy obrazowania w oprogramowaniu obsługującym skaner, aby uwzględnić akwizycję tłumienia CT, 60-minutową dynamiczną akwizycję PET C-11 (dyskryminacja na poziomie 350 - 650 keV, okno koincydencji 3,438 ns), histogram (20 klatek: 5 x 15 s, 4 x 1 min, 11 x 5 min; z korekcją czasu martwego) i rekonstrukcja 3DOSEM-OP (2 iteracje, 18 podzbiorów) w celu stworzenia obrazów 128 x 128 x 159 o rozmiarze woksela 0,776 x 0,776 x 0,96 mm.
- Przeprowadź kondycjonowanie źródła promieniowania rentgenowskiego za pomocą panelu kalibracji CT znajdującego się w lewym górnym rogu interfejsu. Kalibracja ta musi być przeprowadzana co tydzień lub przed skanowaniem, jeśli system nie był używany w ciągu ostatnich 48 godzin.
- Wykonaj kalibrację ciemności/jasności (D/L) i przesunięcia środkowego (C/O).
- Naciśnij przycisk kalibracji CT (X) w lewym górnym rogu interfejsu.
- Wybierz D/L i C/O dla pliku CT, który będziesz uruchamiać, zdejmij łoże z suwnicy i uruchom kalibrację D/L.
- Włóż łoże narzędzia kalibracyjnego do skanera i uruchom kalibrację C/O, upewniając się, że wybór w interfejsie został przełączony na "narzędzie do kalibracji" zamiast "paleta 70 mm".
- Wyjmij narzędzie do kalibracji i przywróć standardowe łóżko PET, upewniając się, że wybór w interfejsie został zmieniony z powrotem na "paletę 70 mm".
- Przymocuj łóżko do obrazowania z 4 myszami na platformie skanera za pomocą taśmy i przymocuj rurkę anestezjologiczną (Rysunek 1A). Upewnij się, że izofluran przepływa przez rurki i że nie ma żadnych załamań.
- Popchnij łóżko do przodu, tak aby znalazło się w środku pola widzenia (FOV), zamknij drzwi CT i uzyskaj widok zwiadowczy CT, aby upewnić się, że łóżko jest we właściwej pozycji.
- Przeprowadzić "standardową" kalibrację skanera PET/CT przy użyciu wyprodukowanego przez siebie fantomu zawierającego znaną dawkę roztworu C-11 jako źródło promieniowania.
- Przygotować strzykawkę o pojemności 20 ml wypełnioną dawką znacznika równoważną dawce podanej jednej myszy (~250 - 350 μCi/9 - 13 MBq znacznika C-11 rozcieńczonego w roztworze soli fizjologicznej).
- Zapisać aktywność w wzorcu za pomocą kalibratora dawki i zanotować czas pomiaru.
- Przeprowadź skan PET/CT standardu przy użyciu dokładnie tych samych parametrów, które zostaną użyte do obrazowania myszy (jak opisano powyżej). Rób to co tydzień, aby utworzyć współczynnik korekcyjny, który skaner PET zostanie zastosowany do danych obrazowania.
2. Konfiguracja przestrzeni roboczej do obrazowania PET/CT
- Stwórz sterylne środowisko, używając środka dezynfekującego z wirusobójczym środkiem (patrz Tabela materiałów) i umieszczając ochronną wyściółkę chłonną na wszystkich powierzchniach.
- Upewnij się, że butle z izofluranem i tlenem są odpowiednio napełnione.
- Przygotować cewniki do żył ogonowych, wypełniając strzykawkę o pojemności 1 ml (wyposażoną w końcówkę igły 27,5 g) 0,9% chlorkiem sodu (sterylny roztwór soli fizjologicznej) i przepłukując przez cewnik motylkowy o masie 27,5 g i średnicy 24 cm. Odetnij skrzydełka cewnika przed kaniulacją, aby upewnić się, że nie blokują widoku żyły ogonowej i ułatwić przenoszenie myszy do skanera bez przesuwania cewnika.
- Upewnij się, że cały niezbędny sprzęt jest rozłożony na stanowisku pracy, w tym zapasowe strzykawki do "płukania" (wypełnione sterylnym solą fizjologiczną), lubrykant do oczu, waciki z etanolu, lampy grzewcze, przygotowane cewniki (wstępnie napełnione solą fizjologiczną), taśma chirurgiczna, klej do tkanek, strzykawki dozujące 0,5 ml, nożyczki i zapalniczka do uszczelnienia cewnika po pomyślnym umieszczeniu w żyle ogonowej (Rysunek 1B).
3. Przygotowanie i kaniulacja zwierząt
- Zważ myszy, aby określić maksymalną objętość, jaką można wstrzyknąć każdej myszy (i.e., Objętość znacznika i jakiejkolwiek podanej soli fizjologicznej nie może przekraczać 10% masy ciała).
- Znieczulij myszy w komorze indukcyjnej za pomocą 3% izofluranu i utrzymuj na poziomie 1-2% (2 l/min 100% O2).
- Nałóż smar do oczu na każdą mysz i potwierdź znieczulenie za pomocą odruchu pedałowania (szczypanie palców). W razie potrzeby dostosuj poziom znieczulenia.
- Umieść mysz na podgrzewanym łóżku wyposażonym w stożek nosowy, aby dostarczyć izofluran w tempie 1-2% (2 l/min 100% O2).
- Podczas gdy mysz jest znieczulona, wykonaj kaniulację żyły ogonowej przy użyciu następującego protokołu:
- Umieść mysz na boku, aby odsłonić jedną z żył bocznych, podczas gdy głowa pozostaje w stożku nosowym.
- Ogrzej ogon za pomocą lampy grzewczej, uważając, aby nie przegrzać ani nie poparzyć ogona, a następnie przetrzyj go wacikiem nasączonym alkoholem, aby rozszerzyć żyłę i wysterylizować miejsce wstrzyknięcia.
- Trzymaj igłę skosem do góry i wyrównaj ją z żyłą pod ostrym kątem.
- Lekko dociśnij, aby nakłuć skórę i wyrównać igłę tak, aby znalazła się w jednej linii z żyłą.
- Delikatnie popchnij do przodu kilka milimetrów za skos, aby igła weszła do żyły.
- Upewnij się, że cewnik jest w środku, podając mały (10-20 μl) roztwór soli fizjologicznej. Sól fizjologiczna powinna płynnie opuścić strzykawkę, a żyła powinna się udrożnić. Jeśli zaobserwuje się jakikolwiek opór lub ciśnienie wsteczne, prawdopodobnie cewnik nie znajduje się w żyle i zaleca się ponowną próbę kaniulacji. Jeśli zaobserwuje się krzepnięcie, użyj heparyny (1,000 jednostek heparyny na ml soli fizjologicznej) do konfiguracji kaniulacji i płukania.
UWAGA: Oceniliśmy kaniulację z heparyną i bez heparyny u interesującego nas szczepu myszy, a ponieważ nie zaobserwowano krzepnięcia, do kaniulacji użyto samej soli fizjologicznej. - Przymocuj cewnik do ogona za pomocą małej kropli kleju tkankowego, a następnie taśmy chirurgicznej, aby upewnić się, że cewnik pozostaje nieruchomy podczas przenoszenia myszy do skanera.
- Wyjmij strzykawkę z płukaniem z końca cewnika i uszczelnij koniec zapalniczką, upewniając się, że badacz nie znajduje się w pobliżu izofluranu lub etanolu.
- Powtórz tę czynność dla 3 dodatkowych myszy, tak aby wszystkie 4 myszy do skanowania zostały kaniulowane i przygotowane.
- Włącz przepływ znieczulenia (2,5% izofluranu, 2 l/minutę 100% O2) podłączony do PET/CT i ostrożnie ustaw myszy w pozycji leżącej na łóżku skanera, upewniając się, że cewniki pozostają na swoim miejscu, a głowa każdej myszy jest prosta i bezpieczna w stożku nosowym. Przyklej głowę i ciało każdej myszy do łóżka miękką taśmą chirurgiczną, upewniając się, że oddychanie nie jest ograniczone przez umieszczenie taśmy. Zapisz pozycję każdej myszy, aby umożliwić prawidłowe przypisanie lokalizacji i grupy do analizy obrazu.
- Utrzymuj myszy w cieple przez cały czas trwania procedury (e.np. używając lampy grzewczej lub systemu pompy gorącego powietrza, aby zapewnić myszom ciepło bez przegrzania). Monitoruj częstość oddechów wszystkich myszy, wizualnie, jeśli używasz otwartej suwnicy lub za pomocą systemu zdalnego monitorowania za pomocą podkładek oddechowych, i w razie potrzeby zmieniaj poziomy znieczulenia.
4. Akwizycja tomografii komputerowej
- Gdy zwierzęta są bezpieczne w łóżku, a oddychanie jest stabilne, włącz celownik laserowy i przesuń łóżko skanujące tak, aby zrównało się z mózgiem wszystkich czterech myszy. Przesuń łoże skanera do pozycji akwizycji (pozycja 3) tak, aby mózgi myszy znajdowały się jak najbliżej środka pola widzenia.
- Uzyskaj obraz myszy w widoku zwiadowczym, aby zweryfikować ich pozycję (użyj pola widzenia 200 mm) i dostosuj pozycję, przeciągając pole FOV na interfejsie, jeśli to konieczne. Kliknij "Rozpocznij przepływ pracy" w oprogramowaniu skanera, aby rozpocząć tomografię komputerową, upewniając się, że wybrałeś opcję "wyświetl interaktywne monity użytkownika", aby skanowanie PET można było rozpocząć ręcznie przed wstrzyknięciem znacznika.
5. [11C]DPA-713 Przygotowanie dawki
- Syntetyzować [11C]DPA-713, upewnienie się, że nosisz odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE) do pracy z radioaktywnością, w tym fartuch laboratoryjny, rękawice oraz osobiste dozymetry na palce i ciało. Upewnij się, że regularnie zmieniasz rękawice, aby zapobiec skażeniu radioaktywnemu i zwiększaj odległość od źródła promieniowania, jeśli to możliwe.
- Za pomocą kleszczy ostrożnie przenieść fiolkę ze znacznikiem radioaktywnym za ołowianą osłonę.
- Przygotować strzykawki z dawką 0,5 ml dla każdej myszy, zawierające około 250-350 μCi/9-13 MBq w objętości 100-200 μl, aby zapewnić dawkę odpowiednią do 60-minutowego dynamicznego skanowania PET (podawana dawka powinna być ustalona z uwzględnieniem okresu półtrwania izotopu i osi czasowej projektu badania, przy czym objętość zależy od masy ciała myszy).
- Zmierzyć aktywność za pomocą kalibratora dawki ustawionego na C-11, znajdującego się w bliskiej odległości od miejsca kaniulacji, i zapisać czasy pomiaru i wstrzyknięcia, aby umożliwić korekcję zaniku. Przygotuj dawki tuż przed zakończeniem tomografii komputerowej, aby ograniczyć rozpad i upewnić się, że pożądany poziom radioaktywności zostanie wstrzyknięty każdej myszy.
- Sprawdzić, czy w strzykawce dozującej nie ma pęcherzyków powietrza przed pomiarem aktywności i wstrzyknięciem do każdej myszy.
6. Akwizycja PET
- Gdy myszy automatycznie przejdą z CT do PET, ustaw tył skanera dla [11C]Wstrzyknięcie DPA-713 (Rysunek 1C). Umieść ochronną chłonną wyściółkę na półce i upewnij się, że nożyczki i zapalniczka są pod ręką.
- Przeciąć zapieczętowaną rurkę cewnika nożyczkami, sprawdzić, czy linie cewnika są wolne od pęcherzyków i upewnić się, że kaniula nadal znajduje się w żyle, wykonując płukanie solą fizjologiczną w ilości 10-20 μl. Załadować strzykawki z odmierzoną dawką z kroku 5.4 do każdego z 4 cewników, śledząc, jaka dawka została podana każdej myszy.
- Kliknij "OK", gdy skanowanie PET jest gotowe do rozpoczęcia, jednocześnie uruchamiając 10-sekundowy timer. Poproś dwóch badaczy z tyłu skanera ze strzykawkami dozującymi w ręku, aby wstrzyknąć wszystkie 4 myszy jednocześnie, gdy zegar osiągnie zero. Przepłucz każdy cewnik 50-100 μl soli fizjologicznej (w zależności od długości rurki cewnika —, tj. objętości martwej), aby upewnić się, że pełna dawka dostanie się do żyły ogonowej, i ponownie uszczelnij rurkę za pomocą zapalniczki.
- Zmierzyć dawkę strzykawki za pomocą kalibratora dawki, aby uzyskać resztkową wartość radioaktywności (wszelkie substancje śladowe pozostałe w strzykawce). Zwróć uwagę na wartości i czas ich rejestrowania.
- Po zakończeniu skanowania ustaw łóżko PET w pierwotnej pozycji za pomocą poziomego przycisku "home" w panelu sterowania ruchem. Wyjmij myszy ze skanera i ostrożnie wyjmij cewnik. Delikatnie uciskaj miejsce kaniulacji, aby zapobiec nadmiernemu krwawieniu.
- Zmierzyć pozostałą aktywność w cewniku za pomocą kalibratora dawki.
- Jeśli myszy mają zostać odzyskane, upewnij się, że odbywa się to w ciepłym środowisku (e.g. w pudełku z podgrzewaną podkładką pod spodem lub zawierającym rękawicę wypełnioną ciepłą wodą), aby ułatwić powrót do zdrowia. Jeśli planujesz eutanazję myszy, umieść je w komorze indukcyjnej zawierającej izofluran, aby pozostały znieczulone przed eutanazją przez perfuzję.
- Aby zrekonstruować dane, otwórz oprogramowanie zarządzające przetwarzaniem końcowym (zobacz Tabela materiałów), które automatycznie zrekonstruuje każdy skan przy użyciu danych histogramu, które zostały wygenerowane z pliku lst.
7. Dynamiczna analiza obrazu PET
1. Otwórz oprogramowanie do analizy obrazu (patrz Tabela materiałów) i kliknij ikonę "otwarte dane", aby załadować obraz CT (jako źródło) i ikonę "dołącz dane", aby załadować dynamiczny PET (jako odniesienie).
2. Przeprowadź wizualną kontrolę jakości danych za pomocą operatora szeregów czasowych w menu rozwijanym: Wybierz odniesienie ("ref") i "global" i zastosuj odpowiednie miny i maksimum dla skali kolorów. Wizualizuj dynamiczne dane PET klatka po klatce, weryfikując absorpcję radioaktywności i sprawdzając, czy w skanowaniu nie ma żadnych zakłóceń w ruchu.
3. Utwórz przeciętny obraz PET za pomocą "operatora arytmetycznego".
1. Wybierz "średnia wybrana", odznacz "ref" i upewnij się, że wejście 1 ("Inp1"), wejście 2 ("Inp2") i gwiazda wejściowa ("Inp*" - obejmuje resztę ramek PET w skanowaniu) są wybrane, aby utworzyć średnią ze wszystkich ramek PET.
2. Przejdź do zakładki "menedżer danych" (DM) i przeciągnij średni obraz w górę do pozycji "input1" w celach wizualizacyjnych. Rozłóż ponownie skalę kolorów, klikając automatyczne obliczenia w narzędziu "min-max".
4. Zarejestruj przekładnik prądowy w przeciętnym pliku PET za pomocą funkcji "automatyczne 3D" w menu rozwijanym "zmiana orientacji/rejestracja".
1. Wybierz "ref" i "Inp1", a następnie wybierz rejestrację "sztywna", "szybka", "Inp1 do Ref". Sprawdź wzrokowo pasowanie we wszystkich 3 wymiarach i w razie potrzeby ręcznie dostosuj w zakładce "ręczne 3D" za pomocą funkcji "przesunięcie" i "obrót".
2. Jeśli rejestracja jest zadowalająca, wybierz "Inp2" i "Inp*" i zastosuj do wszystkich ramek PET, klikając znacznik wyboru. Kliknij prawym przyciskiem myszy pliki CT i PET w DM i zapisz jako surowe.
5. Przytnij mózg jednej myszy na raz w celu analizy mózgu, korzystając z tomografii komputerowej jako przewodnika: Wybierz "przycinanie" z menu rozwijanego i przeciągnij granice obrazu, aby przyciąć głowę myszy poniżej pnia mózgu. Zmień orientację obrazów PET i CT za pomocą funkcji "ręcznej reorientacji 3D", jak opisano powyżej, tak aby czaszka była prosta we wszystkich wymiarach.
6. Załaduj obraz MR dla tej myszy (w formacie DICOM) za pomocą przycisku "dołącz dane" w lewym górnym rogu interfejsu. Przesuń MR za pomocą "ręcznej reorientacji 3D" i dopasuj do czaszki na obrazie CT (upewnij się, że wszystkie modalności są w tej samej orientacji).
7. Narysuj ROI obrysu na obrazie MR za pomocą narzędzia "3D ROI".
1. Wyłącz wizualizację PET, odznaczając ją na karcie kontrolera wizualnego (VC) i użyj tylko MR i CT do narysowania ROI.
2. Kliknij przycisk "dodaj ROI", aby utworzyć nowy ROI i nazwać go "infarct". Wybierz "narzędzie splajnu", kliknij lewym przyciskiem myszy, aby narysować obramowanie ROI i kliknij prawym przyciskiem myszy, aby je zamknąć.
3. Powtórz wszystkie plasterki obejmujące pociągnięcie, uważając, aby nie uchwycić żadnej części czaszki w ROI, przy czym najlepszą praktyką jest pozostawienie luki woksela między granicą czaszki a ROI pociągnięcia.
8. Wygeneruj kontralateralny zwrot z inwestycji za pomocą objętości zawału.
1. Utwórz nowy zwrot z inwestycji i oznacz go jako "kontralateralny". Kliknij prawym przyciskiem myszy ROI zawału i wybierz "eksportuj". Przeciągnij ROI do pozycji 2 ("Inp1").
2. Po wybraniu tylko "Inp1" zastosuj przewrót w lewo w prawo za pomocą funkcji "operator" w menu "reorientacja/rejestracja". Zaznacz pole "ROI", wybierz "tylko widok" i ręcznie przenieś nowy ROI do tego samego regionu po stronie przeciwnej. Wybierz operator "arytmetyczny" i zastosuj mnożenie skalarne 2 do nowego ROI, umożliwiając niezależną kwantyfikację ROI.
3. Wróć do narzędzia 3D ROI. Przejdź do zakładki "eksperckie i eksperymentalne" i kliknij przycisk "importuj ROI". Wybierz Inp1 w oknie dialogowym, aby załadować nowy wolumin jako kontralateralny zwrot z inwestycji.
9. Kliknij prawym przyciskiem myszy przeciętny obraz PET, rozładuj go i ponownie włącz PET. Wygeneruj ilościowe wyniki absorpcji za pomocą ikony "eksportuj wyniki" w narzędziu 3D ROI.
10. W razie potrzeby wykonaj dodatkową analizę podzielonego mózgu (tj. automatyczne generowanie ROI regionów prawej i lewej półkuli mózgu przy użyciu modułu wtyczki atlasu mózgu myszy 3D dla oprogramowania Vivoquant).
1. Ponownie załaduj zarejestrowane obrazy PET/CT.
2. Zaimportuj atlas mózgu myszy, klikając menu "moduły zaawansowane" i wybierając narzędzie atlasu mózgu 3D. Wybierz "wszystkie regiony w lewo / w prawo" w "ustawieniach zaawansowanych" i kliknij "uruchom", aby zaimportować atlas 3D.
3. Ręcznie dopasuj atlas do mózgu, używając czaszki jako obramowania.
4. Uruchom ponownie atlas, upewniając się, że zaznaczono opcję "importuj ROI 3D", aby wygenerować arkusz kalkulacyjny z wynikami dla wszystkich 14 ROI lewej i prawej półkuli (rdzeń, móżdżek, śródmózgowie, most, kora, hipokamp, wzgórze, podwzgórze, prążkowie, pallidum, opuszki węchowe, ciało modzelowate i istota biała).
11. Określ ilościowo wychwyt znacznika w śledzionie za pomocą oprogramowania operacyjnego skanera (patrz Tabela materiałów).
1. Załaduj pliki obrazów PET i CT, podświetlając je w bazie danych i klikając "analiza ogólna".
2. Kliknij w zakładkę rejestracji i współrejestruj obrazy PET i CT klikając w ikonę "sztywna rejestracja".
3. Kliknij zakładkę kwantyfikacji ROI, kliknij ikonę "utwórz ROI" i nazwij ją śledzioną.
4. Wybierz narzędzie "sferyczne", aby narysować ROI śledziony za pomocą pliku CT w celach informacyjnych, upewniając się, że nie nakłada się na wychwyt nerkowy (korzystając z obrazu i sygnału PET, aby uniknąć rozlania się z nerek).
5. Edytuj ROI, aby utrzymać stałe wielkości ROI między zwierzętami.
12. Oblicz standardową wartość korekcji dla normalizacji wychwytu.
1. Załaduj dane PET/CT ze standardowego skanu i utwórz zwrot z inwestycji w butlę obejmujący strzykawkę o pojemności 20 ml za pomocą narzędzia "ręczny zwrot z inwestycji 3D".
2. Uzyskaj poziom radioaktywności zawarty w normie za pomocą ikony arkusza kalkulacyjnego.
3. Wykorzystać ten wynik nCi/cc i oryginalnie zarejestrowaną radioaktywność dla wzorca (tj. pomiar wzorca za pomocą kalibratora dawki w nCi/cc) w celu utworzenia współczynnika korygującego dla wartości wychwytu PET. Oznacza to, że należy podzielić radioaktywność wzorca zarejestrowaną przez kalibrator dawki przez radioaktywność obliczoną na podstawie obrazu PET wzorca.
13. Użyj czynności dawki i czasu pomiarów, aby zaniknąć prawidłowo do czasu akwizycji PET dla wszystkich myszy (tj. obliczyć aktywność dawki na początku skanowania PET).
14. Powtórzyć te czynności dla wartości resztkowych i odjąć od dawki skorygowanej o rozpad, aby obliczyć dokładną aktywność otrzymaną przez każde zwierzę.
15. Po zastosowaniu tej korekcji zaniku zastosuj również korekcję standardową, aby upewnić się, że dane są na odpowiednim poziomie aktywności. Upewnij się, że te poprawki są stosowane do ręcznie rysowanych wyników ROI, a dane ROI atlasu mózgu są istotne dla lokalizacji dMCAO (tj. Kora, hipokamp i prążkowie).
16. Obliczyć %ID/g dla wszystkich ROI, używając następującego równania: %ID/g = (radioaktywność ROI w nCi/cc / dawka skorygowana o rozpad otrzymana w nCi/cc) x100. Wykreśl %ID/g jako funkcję czasu, używając oprogramowania do tworzenia wykresów, aby wygenerować krzywe aktywności w czasie dla każdego ROI.
17. Użyj oprogramowania skanera do ostatecznej wizualizacji obrazu i generowania figur. Normalizuj obrazy zgodnie z dawką skorygowaną o zanik otrzymaną przez każdą mysz w czasie skanowania, upewniając się, że wszystkie obrazy są w tej samej skali %ID/g.
UWAGA: Jest to konieczne, aby umożliwić dokładne porównanie obrazów z różnych myszy i/lub obrazów z badań przeprowadzonych w różnych dniach.