Monitorowanie morfologiczne i fizjologiczne sferoid nowotworowych za pomocą optycznej koherentnej tomografii

Streszczenie

Źródło: Huang, Y. et. al., Podłużne monitorowanie morfologiczne i fizjologiczne trójwymiarowych sferoid nowotworowych za pomocą optycznej tomografii koherentnej. J. Vis. Exp. (2019)

Ten film demonstruje zastosowanie koherencji optycznej tomografia (OCT) do monitorowania sferoid guza w płytce wielodołkowej poprzez przechwytywanie obrazów przekroju poprzecznego o wysokiej rozdzielczości. Analizując odbicia światła od struktur komórkowych, OCT konstruuje modele 3D w celu oceny cech morfologicznych, takich jak rozmiar i kształt, jednocześnie odróżniając komórki żywotne od nieżywotnych na podstawie zmian rozpraszania światła w czasie.

Protokół

1. Przygotowanie komórek

1. Zaopatrz się w linie komórkowe od kwalifikowanego dostawcy.
   UWAGA: Sprawdź, czy komórki z interesujących linii komórkowych mogą tworzyć sferoidy w pożywce hodowlanej lub za pomocą substratu (macierzy błony podstawnej, takiej jak Matrigel). Zajrzyj do literatury lub wykonaj jedną rundę eksperymentu wstępnego, aby to sprawdzić.
2. Rozmrozić zamrożone komórki zgodnie ze specjalną procedurą zapewnioną przez dostawcę linii komórkowej. Ogólną procedurę można znaleźć w innym miejscu.
3. Hoduj komórki przez 1-2 pasaże w kolbach hodowlanych o średnicy 25 cm². Komórki są następnie gotowe do użycia do hodowli komórek 3D.
4. Codziennie monitoruj stan zdrowia komórek i utrzymuj je w inkubatorze w standardowych warunkach (37 °C, 5% CO₂, wilgotność 95%). W razie potrzeby odśwież nośnik.
   UWAGA: Pożywka hodowlana składa się z pożywki Dulbecco's Modified Eagle (DMEM) (4,5 g/L glukozy), 1% antybiotyku przeciwgrzybiczego i 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Subkultura komórek, zanim osiągną zbieg w kolbie hodowlanej. Postępuj zgodnie z wytycznymi dotyczącymi hodowli komórkowych dostarczonymi przez dostawcę. Ogólną procedurę można znaleźć w innym miejscu.
5. Przeprowadzić hodowlę komórkową 3D na płytkach wielodołkowych w oparciu o następujący ogólny protokół.
   1. Wyjąć pożywkę hodowlaną z kolby hodowlanej i przemyć ją wysterylizowanym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS, podgrzanym do temperatury 37 °C).
   2. Ponownie zawiesić komórki, dodając 1 ml trypsyny, kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA, 0,5%) do kolby na 3 minuty. Następnie dodaj pożywkę hodowlaną, aby rozcieńczyć trypsynę.
   3. Przenieś zawiesinę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wiruj przez 5 minut w temperaturze 500 x g i temperaturze pokojowej.
   4. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 4 ml wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej. Pobrać pipetą jedną kroplę próbki na hemocytometr w celu zliczenia komórek w celu określenia stężenia komórek. Rozcieńczyć komórki do stężenia odpowiedniego do wysiewu (e.g., 3,000 komórek/ml).
      UWAGA: Zoptymalizuj początkowe stężenie komórek sferoidy dla każdej linii komórkowej i każdego rodzaju płytki wielodołkowej (96-dołkowej, 384-dołkowej lub 1536-dołkowej).
   5. Komórki nasienne na okrągłodenną płytkę wielodołkową o ultra niskim przyczepie (ULA). Dodaj 200 μl zawiesiny komórkowej do każdej studzienki o stężeniu 3,000 komórek/ml, tak aby każda studzienka miała około 600 komórek.
   6. W temperaturze pokojowej (RT) odwirować całą płytkę za pomocą adaptera płytkowego przez 7 minut, zaraz po wysianiu, z prędkością 350 x g lub najniższą dostępną prędkością.
      UWAGA: Wirówka pomaga zebrać komórki do środka studzienki, aby ułatwić tworzenie pojedynczej, jednolitej sferoidy. Etap wirowania jest wykonywany tylko raz na początku, aby utworzyć sferoidy guza. Nie powtórzy się, gdy sferoidy guza zaczną rosnąć.
   7. Utrzymuj płytkę wielodołkową w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ w inkubatorze hodowlanym i odświeżaj pożywkę hodowlaną co 3 dni.
      UWAGA: Czas wzrostu może się różnić w zależności od warunków hodowli 3D. W naszym badaniu 3,000 komórek / ml jest używanych zarówno dla linii komórkowych U-87 MG, jak i HCT 116 na 96-dołkowych płytkach, dzięki czemu sferoida może wzrosnąć do ~ 500 μm w ciągu 4-7 dni dla komórek HCT 116. Opierając się na ogólnym protokole hodowli 3D, rozważ dodanie suplementów pożywek i czynników wzrostu dla różnych modeli sferoidalnych.
   8. Wykonuj obrazowanie optycznej koherentnej tomografii (OCT) sferoidów guza co 3-4 dni w celu podłużnego badania ich wzrostu.
      UWAGA: Zalecane punkty czasowe dla obrazowania OCT to dzień 4, dzień 7, dzień 11, dzień 14, dzień 18 i dzień 21.

2. Wysokoprzepustowa platforma obrazowania OCT

UWAGA: Zobacz Rysunek 1 aby uzyskać szczegółowe informacje na temat niestandardowego systemu obrazowania OCT użytego w tym badaniu.

1. Wybierz odpowiednie szerokopasmowe źródło światła dla systemu OCT do obrazowania sferoidy guza.
   UWAGA: Tutaj jako szerokopasmowe źródło światła zastosowano diodę superluminescencyjną (SLD, Rysunek 1A, B) o centralnej długości fali ~1,320 nm i szerokości pasma 110 nm została użyta jako szerokopasmowe źródło światła.
2. Skonstruuj ramię referencyjne i ramię próbki systemu OCT zgodnie ze schematami (Zobacz Rysunek 1A, B). Tabela of Materials zawiera listę komponentów optycznych potrzebnych do budowy systemu OCT. Upewnij się, że długości ścieżki optycznej ramienia odniesienia i ramienia próbki są ściśle dopasowane.
3. Skonstruuj spektrometr, w tym kolimator, siatkę, soczewkę F-theta i kamerę do skanowania liniowego (Zobacz Rysunek 1C w celu konfiguracji), aby uzyskać szczegółowe informacje na temat konstrukcji spektrometru OCT. Alternatywnie wybierz komercyjny spektrometr, który pasuje do środkowej długości fali źródła światła. Upewnij się, że spektrometr jest prawidłowo ustawiony, aby pokryć całą szerokość pasma lasera, osiągnąć wysoką wydajność zbierania fotonów i zapewnić powolne wymywanie wzoru zakłóceń.
4. Scharakteryzuj wydajność systemu OCT, w tym następujące wskaźniki, takie jak moc ramienia próbki, całkowita głębokość obrazowania, czułość zależna od głębokości, rozdzielczość osiowa, głębia ostrości i rozdzielczość boczna. Umieść słaby reflektor (e.g., lustro z filtrem o neutralnej gęstości) jako próbkę, aby zmierzyć czułość zależną od głębokości, rozdzielczość osiową i głębię ostrości. Umieść docelowy wykres testowy rozdzielczości Sił Powietrznych Stanów Zjednoczonych (USAF) jako próbkę, aby sprawdzić rozdzielczość poprzeczną.
5. Wybierz zmotoryzowany etap translacji, aby zapewnić poziomy ruch płytki wielodołkowej w celu zobrazowania sferoid guza w różnych dołkach (patrz Rysunek 1B). Użyj stolika o zakresie przesuwu większym niż 108 mm x 72 mm, aby zapewnić pełne skanowanie wszystkich dołków płytki wielodołkowej. Korzystaj z dwuwymiarowego (2D) lub trójwymiarowego (3D) zmotoryzowanego stolika translacyjnego ze sterowaniem programowym, aby umożliwić precyzyjną lokalizację każdego odwiertu i automatyzację systemu OCT w celu obrazowania o wysokiej przepustowości.
6. Użyj adaptera do płytek lub zaprojektuj uchwyt na płytkę (za pomocą druku 3D), aby utrzymać płytkę wielodołkową w ustalonej pozycji.
7. Przed przeprowadzeniem jakiegokolwiek obrazowania OCT należy skorygować nachylenie i obrót płytki wielodołkowej za pomocą stolika przechylającego 2D i stopnia obrotowego zamontowanego na stoliku translacyjnym (patrz Rysunek 1D), aby zminimalizować zmienność płaszczyzny ostrości z różnych dołków. Użyj D2, D11, B6, D6 i G6 jako studzienek prowadzących podczas monitorowania ich względnych pozycji na obrazach OCT (Rysunek 1A).
8. Dostosuj obrót płyty, aby upewnić się, że krawędzie są równoległe do kierunku ruchu sceny, tak aby studzienki pozostały w tych samych pozycjach poziomych na obrazach OCT (Rysunek 1E). Dostosuj nachylenie płytki tak, aby było równoległe do stołu optycznego, tak aby studzienki pozostały w tych samych pionowych miejscach do obrazowania OCT (Rysunek 1F).
   UWAGA: Regulacja kąta nachylenia i ostrości pomaga zoptymalizować jakość obrazu OCT dla wszystkich dołków. Jednak zmiany wysokości pożywek hodowlanych w różnych studzienkach mogą powodować zmiany w ścieżce optycznej, co może prowadzić do rozogniskowania obrazu sferoidalnego. Autofokus może być zaimplementowany do kontrolowania płaszczyzny ogniskowej obrazowania OCT w celu uzyskania zoptymalizowanej jakości obrazu. Etap regulacji nie rozwiązuje problemu złej jakości obrazu OCT sferoidy guza z powodu następujących problemów: sferoida zapada się ze względu na początkowe miejsce wysiewu; uniesienie sferoidów po osadzeniu w biofabrykowanych matrycach zewnątrzkomórkowych; słaba jakość płyty z dużymi wahaniami wysokości dna studni. W celu optymalizacji wydajności systemu obrazowania OCT można zaimplementować dodatkowe sterowanie programowe z funkcjami automatycznego ustawiania ostrości lub samoczynnego wyrównywania.
9. Aby sekwencyjnie zbierać dane z każdej studni, niestandardowy program komputerowy steruje akwizycją obrazu OCT i ruchem sceny.

3. Skanowanie OCT i przetwarzanie sferoid guza

1. W dniu obrazowania sferoidów guza w OCT wyjmij płytkę wielodołkową z inkubatora. Przenieś go pod system obrazowania OCT i umieść na adapterze płytki.
   UWAGA: Obrazowanie sferoidów guza w OCT można wykonywać z założoną lub zdjętą pokrywą płytki polistyrenowej. Jednak kondensacja wody na pokrywie spowodowana parowaniem ze studzienek może wpływać na przepuszczalność światła i zniekształcać ścieżkę światła, dając mniej optymalne obrazy OCT ze sferoid.
2. Dostosuj wysokość płyty, przesuwając się wzdłuż kierunku z stolika translacji. Utrzymuj pozycję płaszczyzny ogniskowej na poziomie ~100–200 μm poniżej górnej powierzchni każdej sferoidy, aby zminimalizować wpływ niejednolitego profilu ogniskowej pod względem głębokości.
3. W niestandardowym oprogramowaniu ustaw odpowiedni zakres skanowania OCT (e.g., 1 mm x 1 mm), aby pokryć całą sferoidę guza zgodnie z jego etapami rozwoju. Kliknij Zapisz parametry, aby zapisać ustawienie.
4. Użyj niestandardowego oprogramowania, aby uzyskać obrazy 3D OCT sferoid guza jeden po drugim dla wszystkich dołków płytki zawierającej sferoidy. Kliknij przycisk Preview, aby wyświetlić obraz podglądu, a następnie kliknij przycisk Acquire, aby uzyskać obraz OCT.
   UWAGA: Upewnij się, że dane sferoidalne OCT są zbierane, gdy stolik nie jest w ruchu. Sferoida zwykle znajduje się w środku studni z dnem w kształcie litery U. Jednak sferoida może być przesunięta w pożywce hodowlanej, gdy etap przyspiesza lub zwalnia z powodu bezwładności sferoidy w pożywce hodowlanej.
5. Przetwarzaj zestawy danych 3D OCT sferoidów guza, aby generować obrazy strukturalne OCT za pomocą niestandardowego kodu przetwarzania C++. Zobacz Rysunek 2A dla schematu blokowego przetwarzania końcowego danych OCT.
   UWAGA: Zobacz Rysunek 3A dla wygenerowanych obrazów strukturalnych 3D OCT.
   1. Skalibruj rozmiar piksela we wszystkich trzech wymiarach. Przeskaluj obrazy strukturalne OCT w skorygowanych skalach.
      UWAGA: Odległość w kierunku osiowym (kierunek z) obrazów OCT mierzy różnicę ścieżki optycznej między ramieniem odniesienia a ramieniem próbki. W związku z tym współczynnik załamania światła próbki (n) musi być brany pod uwagę podczas kalibracji rozmiaru piksela w kierunku osiowym w celu przeskalowania. W naszym badaniu używamy n = 1,37 jako współczynnika załamania światła sferoidy guza.
6. Wygeneruj kolaż obrazów sferoidalnych za pomocą obrazów 2D OCT w trzech płaszczyznach przekroju XY, XZ i YZ w poprzek środka ciężkości sferoidy. Zobacz Rysunek 4C–E dla reprezentatywnego wyniku kolaży obrazów sferoidalnych. Wykonaj rejestrację obrazu dla wszystkich sferoid, korzystając z funkcji MATLAB dftregistration, aby upewnić się, że centroidy wszystkich sferoid znajdują się w przybliżeniu w tym samym miejscu.
7. Uzyskaj renderowanie 3D sferoidy za pomocą komercyjnego lub niestandardowego oprogramowania.
   UWAGA: Poniższe kroki pokazują, jak uzyskać renderowanie 3D sferoidów guza za pomocą komercyjnego oprogramowania.
   1. Załaduj dane 3D OCT do oprogramowania.
   2. Kliknij panel Surpass. Następnie kliknij Dodaj nowy wolumin. Wybierz tryb Blend do użycia do renderowania 3D.
   3. Dostosuj kąt widzenia, przeciągając obraz za pomocą wskaźnika myszy.

4. Kwantyfikacja morfologiczna sferoid guza 3D

UWAGA: Niestandardowy kod w MATLABie przetwarza tę kwantyfikację. Kliknij przycisk Uruchom, aby rozpocząć proces. Zobacz Rysunek 2B dla schematu blokowego etapów morfologicznej kwantyfikacji sferoid.

1. Określ ilościowo średnicę, wysokość i objętość sferoidy na podstawie średnicy.
   1. Wybierz obrazy 2D OCT w trzech płaszczyznach przekroju poprzecznego XY, XZ i YZ, które przecinają środek ciężkości sferoidy.
   2. Zmierz średnicę i wysokość sferoidy odpowiednio w płaszczyznach XY i XZ.
   3. Oblicz objętość sferoidalną opartą na średnicy za pomocą:

, z założeniem kulistego kształtu guza.

2. Określ ilościowo objętość sferoidalną opartą na wokselach.
   1. Zastosuj filtr uśredniający 3D na danych strukturalnych OCT sferoidy, aby usunąć plamki.
   2. Segmentuj sferoidy guza za pomocą filtra wykrywania krawędzi Canny, klatka po klatce, z odpowiednim progiem oddzielającym obszar sferoidalny guza od dna studni.
   3. Grupuj woksele łączące dla danych 3D (patrz wbudowana funkcja: bwconncomp).
   4. Oblicz średnią odległość między każdym wokselem łączącym w grupie a sferoidalnym środkiem ciężkości (wybranym ręcznie) dla każdej grupy. Zidentyfikuj obszar sferoidalny jako grupę o minimalnej średniej odległości.
   5. Policz liczbę wokseli w obszarze sferoidalnym, a następnie pomnóż przez rzeczywistą objętość pojedynczego woksela (objętość/woksel), uzyskując całkowitą objętość sferoidy.

5. Wykrywanie martwych komórek w sferoidach guza 3D

UWAGA: W ośrodku jednorodnym intensywność rozproszenia wstecznego OCT wykryta w funkcji głębokości (I({{TAG_686}z)) można opisać za pomocą Prawo Beera-Lamberta:

Gdzie z oznacza głębokość, μ to współczynnik tłumienia optycznego, a I0 to intensywność incydentu w próbce. Stąd wyprowadzony współczynnik tłumienia optycznego można wyrazić jako:

Ponieważ obrazy OCT są często wykreślane w skali logarytmicznej, nachylenie profilu intensywności OCT można pobrać w celu wyprowadzenia współczynnika tłumienia optycznego. Zobacz Rysunek 2C dla schematu blokowego generowania map tłumienia optycznego.

1. Wykonaj segmentację, aby usunąć niechciane obszary poza sferoidą. Wykonaj filtr uśrednień 3D, aby stłumić szum plamkowy, który jest nieodłącznie związany z obrazami OCT.
2. Uzyskaj pikselowe współczynniki tłumienia optycznego, liniowo dopasowując profil intensywności OCT w skali logarytmicznej w określonym zakresie głębokości (ruchome okno), wyodrębniając jego nachylenie i mnożąc nachylenie przez -1/2.
   UWAGA: Współczynnik tłumienia dla każdego woksela w segmentowanym obszarze sferoidalnym jest obliczany na podstawie nachylenia profilu intensywności OCT w oknie głębokości 10 wokseli (głębokość ~40 μm), przy czym woksel znajduje się w środku okna.
3. Zastosuj powyższe metody (kroki 5.1 i 5.2) do każdego skanu osiowego w klatce i każdej klatki w zestawie danych 3D zawierającym segmentowany obszar sferoidalny, aż zostaną obliczone współczynniki tłumienia optycznego dla wszystkich wokseli segmentowanego obszaru sferoidalnego.
4. Wykonaj progowanie binarne, aby wyróżnić obszar wysokiego tłumienia.
   Podświetl binaryzowaną mapę tłumienia optycznego na oryginalnym obrazie, aby oznaczyć obszar martwych komórek (mieszanie). Wygeneruj renderowany w 3D obraz mieszanej mapy tłumienia, aby zobrazować rozkład 3D obszaru martwej komórki.

Wyniki

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Niestandardowy system obrazowania OCT w domenie spektralnej			Opracowany w naszym laboratorium
Dioda superluminescencyjna (SLD)	Thorlabs	SLD1325	TAG_29{{}}
2×2 jednomodowy łącznik światłowodowy bezpiecznikowy, Rozdział 50:50:50 współczynnik podziału	AC Photonics	WP13500202B201
Ramię referencyjne		{ {TAG_47}}
Tubus obiektywu	Thorlabs
Thorlabs
Soczewka kolimacyjna	Thorlabs	AC080-0202 0-C
Soczewka do ustawiania ostrości	Thorlabs
Thorlabs
Mirror	Thorlabs	{}}
1D Etap translacyjny	Thorlabs
Thorlabs
Postu pedestrialne	Thorlabs
Widelec do zaciskania	Thorlabs
Przykładowa arm
Tubus obiektywu	Thorlabs
Adapter	Thorlabs
Soczewka kolimacyjna	Thorlabs	AC080-020-C
Galwanometr	Thorlabs{{ TAG_195 9}}
Soczewka przekaźnikowa	Thorlabs	AC254-100-C	Dwie soczewki przekaźnikowe do budowy teleskopu setup
Trójkątne mocowanie lustra	Thorlabs
Mirror	Thorlabs
Objective	Mitutoyo		{{ TAG_239}}
Słupek pedestrialny	Thorlabs
Widelec zaciskowy
Kontroler polaryzacji	Thorlabs		{{ TAG_269}}
30mm mocowanie klatki	Thorlabs
Pręt do klatki
Etap			{{ TAG_299}}
Zmotoryzowany etap tłumaczenia 3D	Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd.	JTH360XY
2D Scena uchylna
Etap rotacji	{{TAG_ 325}}
Uchwyt na talerz			Wydrukowane w 3D
Spektrometr
Tubus obiektywu	Thorlabs{{TAG_ 355}}
Adapter	Thorlabs
Soczewka kolimacyjna	Thorlabs	AC080-020-C
Grating	Wasatch	G = 1145 lpmm
{{}}F-theta lens	Thorlabs	FTH-1064-100
Kamera liniowa InGaAs	Sensor Unlimited	SU1024-LDH2
Komponent hodowli komórkowej{{TAG_ 414}}
HCT 116 Linia komórkowa	ATCC	CCL-247
Kolba do hodowli komórkowych	SPL Nauki przyrodnicze	70025
Pipeta	Fisherbrand	14388100
Końcówki do pipet	Sorenson Bioscience	10340{TAG_459{ }}
Gibco GlutaMax DMEM	Thermo Fisher Scientific	10569044
Płodowa surowica bydlęca, certyfikowana, pochodzenia amerykańskiego	Thermo Fisher Scientific	16000044
Antybiotyk-Antybiotyk (100X)	Thermo Fisher Scientific	15240062
Corning 96-well clear round bottom ultra-low microplate	Corning	7007
Gibco PBS, pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010023
Gibco Trypsin-EDTA (0.5%)	Thermo Fisher Scientific	15400054
Forma Series II 3110 Inkubator z płaszczem wodnym CO2 inkubator	Thermo Fisher Scientific	3120
Rękawice	VWR	89428-750
Parafilm	Sigma-Aldrich{{ TAG_555}}	P7793
Transfer pipets	Globe Scientific	138080
Wirówka	Eppendorf	5702 R	Do wirowania probówki 15 ml
Wirówka{{ TAG_583}}	NUAIRE	AWEL CF 48-R	Do odwirowania 96-dołkowej płytki
Mikroskop	Olympus
Lista komercyjnych OCT
SD-OCT system	Thorlabs	Telesto Series
} System SD-OCT	Wasatch Photonics	WP OCT 1300 nm
Oprogramowanie do analizy danych{{TAG_ 637}}
Podstawowa analiza obrazu	NIH	ImageJ	Fidżi również działa.
Renderowanie 3D	Thermo Fisher Scientific	Amira	Oprogramowanie komercyjne. Opcja 1
Renderowanie 3D	Bitplane	Imaris	Oprogramowanie komercyjne. Opcja 2. Używany w protokole
OCT oprogramowanie do akwizycji			opracowany w C++.
Kontrola sceny	Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd.	MRC_3	Włączone do niestandardowego kodu akwizycji OCT
Oprogramowanie do przetwarzania OCT			Niestandardowy opracowany w C++. Wykorzystaj procesor graficzny. Uwzględniony w niestandardowym kodzie pozyskiwania OCT.
Analiza morfologiczna i fizjologiczna			Opracowane na zamówienie w MATLAB

{ TAG_62}}Adapter{{TAG_ 92}}Mocowanie lustra kinematycznego{{ TAG_122}}Ciągły filtr o neutralnej gęstości{TAG_136{ }} {{ TAG_151}}{TAG_166{ }} {{TAG_ 181}}{{ TAG_254 4}}Thorlabs{TAG_284}}Thorlabs }{{{TAG_ 386}} {{TAG_400 }}{{TAG_ 473}}{{ TAG_540 Rękawice{ {TAG_570}}Olympus{{}} }{{ TAG_610}}