Obrazowanie polisomów wyizolowanych z mózgu myszy za pomocą mikroskopii sił atomowych

Abstract

Źródło: Lunelli, L., et. al. Przyglądanie się polisomom mózgu za pomocą mikroskopii sił atomowych. J. Vis. exp.(2016).

Ten film przedstawia obrazowanie polisomów przy użyciu mikroskopii sił atomowych. Arkusz miki pokryty jonami niklu zakotwicza RNA z dołączonymi rybosomami. Próbka jest myta, suszona i umieszczana na stoliku mikroskopowym. Końcówka wspornikowa skanuje powierzchnię próbki, rejestrując ugięcia lasera w celu odwzorowania topologii. Oprogramowanie służy do korekcji zniekształceń i wizualizacji struktur polisomowych o wysokiej rozdzielczości.

Protocol

Uwaga: Aby uniknąć degradacji RNA w próbkach, przygotuj wszystkie bufory przy użyciu wody uzdatnionej DEPC, aby zminimalizować zanieczyszczenie RNazą.

1. Przygotowanie polisomów z całych mózgów

1. Pobieranie tkanek mózgowych (15 min)
   1. Eutanizacja szczepu myszy typu dzikiego C57BL/6 za pomocą CO₂ przez 5 min. Ostrożnie wypreparuj mózg z czaszki, umieść tkankę w probówce o pojemności 1,5 ml i natychmiast umieść ją w ciekłym azocie. Przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
2. Przygotowanie lizatu (30 min)
   1. Sproszkować całą tkankę mózgową za pomocą moździerza i tłuczka pod ciekłym azotem.
   2. Przenieść około 25 mg proszku do zimnej probówki do mikrowirówki i natychmiast (aby uniknąć rozmrożenia sproszkowanej tkanki) dodać 0,8 ml buforu do lizy (patrz Tabela 1) i zakłócić działanie komórki, pipetując szybko w górę i w dół 25 razy.
   3. Odwirować probówkę o stężeniu 12 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C w celu osadzenia resztek komórkowych.
   4. Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki i trzymać probówkę na lodzie przez 15 minut.
   5. Odwiruj probówkę o sile 12 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia jąder i mitochondriów.
   6. Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki.
   7. Supernatant należy przechowywać w temperaturze –80 °C maksymalnie przez 6 miesięcy lub zużyć natychmiast.
3. Przygotowanie gradientu sacharozy i odwirowanie (2 godziny i 30 minut)
   1. Dokładnie umyj probówki ultrawirówek wodą wolną od RNaz (woda uzdatniona dietylopirowęglanem (woda DEPC) lub dostępna) i 3% H₂O₂/DEPC H_{2{{TAG_ 126}}}O solution.
   2. Umieść probówki na lodzie i dodaj 5,5 ml zimnego 50% roztworu sacharozy na dno każdej probówki (patrz Tabela 1 dla roztworów sacharozy). Ostrożnie dodawaj 15% roztwór sacharozy kropla po kropli, trzymając się blisko interfazy, aby zachować ostrą interfazę, aż probówka zostanie całkowicie wypełniona. Gdy rurka jest całkowicie napełniona, zamknij ją gumowym korkiem, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza.
   3. W chłodnym pomieszczeniu delikatnie ułóż rurki poziomo i utrzymuj je w tej pozycji przez 2 godziny. Po tym czasie powoli wyprostuj rurki z powrotem do pozycji pionowej i połóż je na lodzie. Gradienty są teraz gotowe do użycia. Alternatywnie, przygotuj 15-50% gradient sacharozy przy użyciu konwencjonalnego gradientu.
   4. W chłodni ostrożnie usunąć 1,0 ml z górnej części gradientu i nałożyć sacharozę kropla po kropli na lizat cytozolowy (tj. supernatant otrzymany w kroku 1.2).
   5. Ostrożnie opuść rurki do kubełków wahliwego wirnika łyżki. Wirować gradienty przez 100 minut przy 180 000 x g w temperaturze 4 °C za pomocą ultrawirówki.
   6. Po odwirowaniu pozostawić probówki w wiadrach na 20 minut w temperaturze 4 °C, aby ustabilizować gradienty.
4. Frakcjonowanie w gradionym gradieniu sacharozy (2 godz.)
   1. Ostrożnie wyjmij jedną probówkę ultrawirówki z wirnika ultrawirówki i zamontuj ją na urządzeniu kolektorowym systemu frakcjonowania gradientu gęstości. Zebrać frakcje o wielkości 1 ml, aby monitorować absorbancję przy długości fali 260 nm za pomocą detektora UV/VIS (patrz Rysunek 1 górny panel). Zebrane frakcje trzymaj na lodzie.
   2. Przygotować porcje 30-40 μl interesujących nas frakcji. Przechowywać je na lodzie przed przechowywaniem w temperaturze -80 °C do momentu użycia. Nie należy używać podwielokrotności lub frakcji sacharozy, które przeszły więcej niż dwa cykle zamrażania i rozmrażania (patrz Rysunek 1 dolny panel).

2. Przygotowanie próbki do mikroskopii sił atomowych (3 godziny)

1. Za pomocą taśmy odklej arkusze miki.
2. Umyj arkusze miki 3-4 razy wodą DEPC i umieść je na małej szalce Petriego. Następnie osusz powierzchnię za pomocą powietrza.
3. Przykryj mikę 200 μl 1 mM NiSO₄ i inkubować przez 3 minuty w temperaturze suchej.
4. Usuń roztwór niklu, a następnie osusz powierzchnię powietrzem. Wszystkie przyszłe kroki należy wykonać w temperaturze 4 °C, umieszczając płytkę Petriego wraz z miką na lodzie.
5. Rozmrozić podwielokrotność otrzymaną w ppkt 1.4.2 na lodzie i delikatnie dodać całą próbkę kropla po kropli do miki. Za pomocą końcówki o pojemności 100-200 μl rozprowadź próbkę na całej powierzchni miki. Inkubować próbkę na lodzie przez 3 minut.
6. Przykryj arkusz miki kropla po kropli 200 μl zimnego buforu AFM (patrz Tabela 1) i inkubować przez 1 godzinę na lodzie.
7. Obrazowanie w cieczy
   1. Ostrożnie wyjmij mikroskop buforowo-atomowy (AFM) i umyj arkusze miki 3-4 razy 200 μl zimnego buforu-AFM, aby usunąć nadmiar sacharozy. Następnie umyj arkusze miki 3 razy zimnym roztworem myjącym (patrz Tabela 1), pozostawiając powierzchnię miki pokrytą kilkoma mikrolitrami roztworu.
   2. Przejdź do punktu 3 (Akwizycja obrazu).
8. Obrazowanie w powietrzu
   1. Ostrożnie usuń Buffer-AFM i przemyj mikę 3-4 razy 200 μl zimnego Buffer-AFM, aby usunąć nadmiar sacharozy. Następnie umyj mikę 3 razy zimnym roztworem myjącym (patrz Tabela 1) i odcedź nadmiar wody za pomocą papieru.
   2. Pozostawić próbkę do wyschnięcia pod kapturem chemicznym z częściowo otwartą górną częścią szalki Petriego. Po 2 godzinach zamknij szalkę Petriego i przechowuj ją w temperaturze pokojowej (RT). Zmierz próbkę po 2-3 godzinach, ponieważ są stabilne przez lata.

3. Akwizycja obrazu (15 min na obraz po stabilizacji termicznej)

Uwaga: Polisomy unieruchomione na mice można obrazować w powietrzu lub w cieczy w trybie AC.

1. Przymocuj mikę do uchwytu na próbkę za pomocą taśmy dwustronnej.
2. Włóż uchwyt próbki do stolika AFM zgodnie ze wskazówkami producenta. Podczas obrazowania w cieczy, jeśli to możliwe, staraj się utrzymywać próbkę w temperaturze niższej niż 25 °C, aby zwiększyć stabilność polisomu w czasie.
3. Wybierz wspornik odpowiedni do obrazowania AC i zamontuj go na uchwycie końcówki zgodnie ze wskazówkami producenta. W tym przypadku należy użyć wsporników o stałej sile w zakresie 2-20 N/m do obrazowania powietrznego i około 0,1 N/m do obrazowania cieczy.
4. Wyreguluj plamkę lasera na wsporniku i wyzeruj sygnały detektora kwadrantowego.
5. Wybierz odpowiednią częstotliwość jazdy i napędzaj wspornik o amplitudzie 10-20 nm.
6. Zbliż się do próbki, aż końcówka zetknie się z powierzchnią.
7. Wybierz obszar skanowania o wymiarach 2x2 μm, uzyskaj obrazy o rozdzielczości co najmniej 512x512 pikseli (szerokość piksela < 4 nm), a następnie wybierz tryb odejmowania tła na żywo i skalę Z 20-25 nm.
8. Sprawdź obraz pod kątem obecności okrągłych obiektów charakteryzujących się wysokością od 10 do 15 nm w przypadku pozyskiwania w powietrzu oraz 25 i 30 nm w stanie cieczy oraz szerokością w zakresie 25-30 nm. Dostosuj wartość zadaną i parametry sprzężenia zwrotnego, aż do wyświetlenia ostrych obiektów. W dobrych próbkach tło powinno wydawać się stosunkowo płaskie, z niektórymi obiektami o wysokości 2-4 nm (patrz Rysunek 2A i B).
9. Jeśli obraz wygląda dobrze (jak wskazano w punkcie 3.8), należy wykonać kilka (co najmniej dziesięć) skanów o wymiarach 2x2 mikrony w różnych obszarach próbki.
10. (Opcjonalnie). W razie potrzeby uzyskaj obrazy wybranych polisomów w wysokiej rozdzielczości (patrz Rysunek 2C).
11. Zastosuj korekcje programowe (algorytmy odejmowania płaszczyzny i korekcji linia po linii), aby skorygować obrazy AFM, usuwając dowolne efekty przechyłu i dryfu.

4. Analiza danych (30 min na obraz)

1. }Eksportuj obrazy w ImageJ (opcjonalnie: zastosuj współczynnik skali) preferencyjnie przy użyciu formatu kompresji bezstratnej, np. formatu TIFF (patrz Rysunek 3A).
2. Użyj zestawu narzędzi makr ImageJ RiboPick.ijm (do skopiowania do podkatalogu ImageJ macro/toolset), aby policzyć rybosomy w polisomach (zobacz Rysunek 3B) i obliczyć właściwości statystyczne próbki (patrz Rysunek 3C).
   1. Rozpocznij ładowanie obrazu za pomocą narzędzia które inicjuje program.
   2. Wybierz centra rybosomów za pomocą standardowego narzędzia ImageJ (shift + lewy przycisk myszy umożliwia wielokrotny wybór rybosomów). Zaznacz wybrane rybosomy za pomocą narzędzia . Współrzędne rybosomów pojawią się w niestandardowym oknie tekstowym.
   3. Dodać więcej rybosomów do tego samego polisomu, powtarzając procedurę wskazaną w ppkt 4.2.2.
   4. Usuń błędnie oznaczone rybosomy za pomocą narzędzia (rozpocznij usuwanie od ostatniego dodanego rybosomu do pierwszego — tylko w bieżącym polisomie).
   5. Po zakończeniu tworzenia polisomu użyj narzędzia . Gdy numer polisomu jest dodawany jako nakładka do obrazu, okno tekstowe jest aktualizowane.
   6. Użyj opcji aby zapisać plik współrzędnych rybosomu (używane są domyślne jednostki obrazu) oraz obraz PNG, który podsumowuje wybrane rybosomy i polisomy. Oryginalny obraz zostanie zamknięty bez zapisywania.

Tabela 1. Bufory.

10 mM Tris–HCl, pH 7.5

Sacharoza Przygotowanie gradientu (1. 2)

Buffer	Kompozycja	{{}}} Aplikacja
Bufor lizyzy	Przygotowanie lizatu (1.1)
	{{}}10 mM NaCl	{{TAG_ 577}}
	10 mM MgCl2
	1% Triton-X100
	1% Na-deoksycholan
	0..4 U/ml Inhibitor RNazy
{{ TAG_641}}	1 mM DTT
	0..2 mg/ml cykloheksymidu
	{{ TAG_673}}5 U/ml Dnase I
50% roztwór sacharozy{{TAG_687 TAG_698 }}	50% (w/v) sacharozy w
	100 mM NaCl {{TAG_717 }}
	10 mM MgCl2{{ TAG_733}}
	10 mM Tris/HCl pH 7.5
15% roztwór sacharozy	{{ TAG_764}}15% (w/v) sacharozy w	Preparat gradientu sacharozy (1.2)
	100 mM NaCl
10 mM MgCl2
	10 mM Tris/HCl pH 7.5
Rozwiązanie niklu	1 mM NiSO4	Przygotowanie próbki do AFM (2)
Buffer-AFM	100 mM NaCl	}Przygotowanie próbki do AFM (2)
	10 mM MgCl2
	100 μg/ml cykloheksymidu
	10 mM Hepes{{ TAG_924}}
	3% (w/v) sacharoza pH = 7.4
Mycie Rozwiązanie	DEPC-Water	Przygotowanie próbki do AFM (22) )
	{{}}100 μg/ml cykloheksymidu {{ TAG_985}}

{{ TAG_548}}} {{ TAG_610}}{{}}{{ TAG_794}} {{ TAG_824}}

Results

Materials