$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie próbki do skanów mikrotomografii komputerowej (CT)
- Poddaj eutanazji nowonarodzone szczenięta w P8 poprzez uduszenie dwutlenkiem węgla.
- Przeprowadź perfuzję wewnątrzsercową, wprowadzając igłę o rozmiarze 29 z 3 ml 2% paraformaldehydu w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w strzykawce o pojemności 10 ml do komory serca myszy.
UWAGA: Paraformaldehyd jest toksyczny; Nosić odpowiednią ochronę. - Odłącz głowę od ciała za pomocą nożyczek. Usuń całą skórę z głowy za pomocą nożyczek i oderwij czaszkę za pomocą kleszczy, aby wypreparować cały mózg.
- Rób zdjęcia mózgu za pomocą mikroskopu stereoskopowego przy powiększeniu 7,82x, wzmocnieniu 1x, gamma 0,6 i czasie ekspozycji 20 ms.
- Napraw wypreparowane mózgi za pomocą 4% paraformaldehydu w roztworze PBS przez noc.
UWAGA: Paraformaldehyd jest toksyczny; Nosić odpowiednią ochronę. - Następnego dnia odłącz tyłomózgowie za pomocą kleszczy i przemyj roztworem PBS.
- Inkubuj tyłomózgowie w roztworze jodu Lugola przez 48 godzin.
- Po inkubacji krótko wysusz tyłomózgowie na powietrzu, aby usunąć nadmiar płynu Lugola z jodem.
- Zapakuj poplamione jodem tyłomózgowie Lugola w probówkach do mikrowirówek o pojemności 0,65 ml i całkowicie uszczelnij plastikową folią parafinową, aby uniknąć kurczenia się tkanek (Rysunek 1A).
- Umieść probówki do mikrowirówek w plastikowych probówkach o pojemności 5 ml z gąbkami, aby zapobiec ich przesuwaniu się podczas skanowania (Rysunek 1B).
2. Mikrotomografia komputerowa malformacji jamistych mózgu (CCM) w mózgu myszy
- Zamontuj pionowo tyłomózgowie upakowane w rurkę na aluminiowym uchwycie w systemie mikro-CT.
- Ustaw parametry skanowania na 540 projekcji i czas naświetlania 2 s przy warunkach źródła 50 kV i 10 W, aby uzyskać zestawy danych tomograficznych (rozdzielczość obrazu 9,5 μm/piksel).
- Zdjęcia rentgenowskie ze skanu są rekonstruowane automatycznie przez sprzętowe oprogramowanie do rekonstrukcji projekcyjnej dostarczone przez system micro-CT, tworząc serię obrazów 16-bitowych wycinków osiowych (plik "TXM").
3. Analiza zestawów danych mikro-CT
- Otwórz zrekonstruowany plik obrazu (plik "TXM") w oprogramowaniu do analizy 3D i zwizualizuj mózg za pomocą funkcji "renderowanie objętości".
- Przekształć tyłomózgowie do pożądanej orientacji za pomocą funkcji "obwiedni" i "płaszczyzny tnącej".
- Ponownie próbkuj przekształcony obraz w trybie rozszerzonym i zachowaj rozmiar wokseli.
- Utwórz "edytuj nowe pole etykiety" na przekształconym obrazie (3.3) i podświetl tylko tyłomózgowie za pomocą intensywności skali szarości.
- Dodaj podświetlone obszary i uruchom "analizę etykiet", aby uzyskać pomiary całej tyłomózgowia (i.e., całkowita objętość i powierzchnia). Eksport pomiarów do pliku Excel.
- Wizualizuj tyłomózgowie za pomocą funkcji "renderowania izopowierzchni".
- Utwórz kolejne "edytuj nowe pole etykiety" na przekształconym obrazie i podświetl obszary ze zmianami za pomocą intensywności skali szarości.
- Dodaj podświetlone obszary i uruchom analizę "etykiety", aby uzyskać pomiary zmian w obrębie tyłomózgowia (i., całkowita objętość i obszar). Eksport pomiarów do pliku Excel.
- Wizualizacja zmian chorobowych za pomocą funkcji "generuj powierzchnię" i "widok powierzchni".
- Zrób migawkę obrazu tyłomózgowia w żądanej orientacji lub wygeneruj film, aby uzyskać wizualizację 3D zmian chorobowych.
