Obrazowanie podwójnej fluorescencji w celu identyfikacji zróżnicowanych oligodendrocytów

Streszczenie

Źródło: Schott, J. T., et al. Przygotowanie hodowli progenitorowych oligodendrocytów szczurów i kwantyfikacja oligodendrogenezy za pomocą skanowania fluorescencyjnego w podwójnej podczerwieni. J. Vis. Exp. (2016).

Ten film demonstruje zastosowanie obrazowania podwójnej fluorescencji do oceny różnicowania oligodendrocytów od komórek prekursorowych (OPC) wyizolowanych z mózgu młodego szczura. Proces ten obejmuje utrwalanie komórek, znakowanie określonych markerów pierwszorzędowymi i sprzężonymi z fluoroforem przeciwciałami drugorzędowymi oraz wizualizację ich za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Zidentyfikowano zróżnicowane oligodendrocyty wyrażające zarówno podstawowe białko mieliny (MBP), jak i czynnik transkrypcyjny oligodendrocytów 2 (Olig2), odróżniając je od niezróżnicowanych komórek prekursorowych, które wyrażają tylko Olig2.

Protokół

1. Przygotowanie płytek testowych, roztworów podstawowych i pożywek bazowych OPC

Uwaga: Opisywana tutaj pożywka z zasady OPC szczura (Sato) pochodzi z wcześniej opublikowanych badań. Alternatywne preparaty pożywek mogą być również zgodne z tą procedurą.

1. Zawiesić poli-L-lizynę (PLL) do stężenia 10 μg/ml w sterylnej wodzie dejonizowanej. Odpipetować 400 μl rozcieńczonego PLL do każdego dołka czarnościennego, przezroczystego naczynia do hodowli tkankowych z 24 dołkami.
2. Naczynia do hodowli tkankowych należy pokrywać przez 2 godziny w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C lub przez noc w lodówce o temperaturze 4 °C.
3. Odessać PLL z powlekanych naczyń co najmniej 20 minut przed posiewem. Pozostaw pozostałą PLL do wyschnięcia z dołka, umieszczając 24 płytki dołkowe z częściowo uchyloną pokrywką w kapturze do hodowli tkankowych. Sprawdź, czy studzienki są całkowicie suche przed poszyciem izolowanych OPC. Komórki nie będą przylegać do plastiku, w którym występuje płynny PLL.
4. Przygotuj N-acetylo-L-cysteina (NAC) roztwór podstawowy (1,000x): Rozpuść 100 mg N-Acetylo-L-cysteina (NAC) w 20 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco. Porcję i przechowywać w temperaturze -20 °C.
5. Przygotuj roztwór podstawowy hydrokortyzonu (1,000x): Dodaj 1 ml etanolu do 1 mg hydrokortyzonu i zawiruj do rozpuszczenia. Dodać 19 ml DMEM, wymieszać roztwór, porcję i przechowywać w temperaturze -20 °C. Wykazano, że dodanie hydrokortyzonu do pożywki podstawowej zwiększa przeżywalność komórek glejowych.
6. Przygotować roztwór podstawowy d-biotyny (5 000x): Rozpuść 2,5 mg d-biotyny w 50 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Dodaj 1-2 x 5 μl kropli 0,1 N NaOH, aby pomóc w rozpuszczeniu. Porcję i przechowywać w temperaturze -20 °C.
7. Przygotować roztwór podstawowy insuliny (100x): Rozpuścić 25 mg insuliny w 50 ml wody o jakości kultury tkankowej. Dodać 250 μl 1 N HCl i mieszać, aż roztwór będzie klarowny. Sterylizować filtrem 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C do 6 tygodni.
8. Przygotuj roztwór podstawowy Sato (100x):
   1. Przygotuj roztwór podstawowy progesteronu (25 μg/μl): Rozpuść 2,5 mg progesteronu w 100 μl etanolu.
   2. Przygotować roztwór podstawowy seleninu sodu (400 ng/μl): Rozpuścić 4 mg seleninu sodu w 100 μl 0,1 N NaOH. Dodaj 10 ml DMEM i wymieszaj.
   3. Do 100 ml DMEM dodać 1 g ludzkiej apo-transferyny, 1 g albuminy surowicy bydlęcej i 160 mg putrescyny i wymieszać do całkowitego rozpuszczenia. Dodać 25 μl roztworu podstawowego progesteronu, 1 000 μl roztworu podstawowego seleninu sodu i wymieszać. Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
9. Przygotuj pożywkę bazową OPC: na 100 ml DMEM (z 4,5 g/L D-glukozy, L-glutaminą i 110 mg/L pirogronianu sodu), dodać 100 μl NAC, 100 μl hydrokortyzonu, 20 μl d-biotyny, 1 ml insuliny, 1 ml bulionu Sato, 100 μl pierwiastków śladowych B, 2 ml suplementu B-27 (50x) i 1 ml penicyliny/streptomycyny (100x). Sterylizować filtrem 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
10. Przygotować roztwór podstawowy płytkowego czynnika wzrostu AA (PDGF-AA) (1 000x): Rozpuścić 250 μg w 12,5 ml PBS w 0,1% albuminie surowicy bydlęcej (BSA), aby uzyskać roztwór o stężeniu 20 μg/ml. Porcję i przechowywać w temperaturze -80 °C.
11. Przygotuj pożywkę proliferacyjną OPC: Pożywkę bazową OPC uzupełnioną 20 ng/ml PDGF-AA.
12. Przygotuj pożywkę różnicującą OPC: pożywkę bazową OPC uzupełnioną trójjodotyroniną o długości 45 nM.
13. Przygotować bufor kolumnowy: Do 500 ml PBS dodać 2,5 g BSA i 2 ml 0,5 M kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i dostosować pH do 7,2. Sterylizować filtrem 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.

2. Indukcja różnicowania i utrwalania OPC za pomocą 4% paraformaldehydu

Uwaga: Podczas testowania wpływu małych cząsteczek na oligodendrogenezę, rutynowo rozpuszczamy leki w dimetylosulfotlenku (DMSO), aby przygotować 1000 razy więcej zapasów, które można następnie przechowywać w temperaturze -80 °C i rozcieńczać bezpośrednio w pożywkach SATO, aby uzyskać końcowe stężenie 0,1% DMSO. Nie zaobserwowaliśmy żadnych zmian ani w proliferacji, ani w różnicowaniu OPC przy użyciu tego stężenia DMSO (dane nie pokazane).

1. Podgrzej wstępnie podłoże bazowe OPC do 37 °C i rozmroź zapasy do leczenia leków do temperatury pokojowej. Wykonując zabiegi dwukrotnie, należy przygotować około 1,25 ml pożywki na grupę zabiegową w probówce o pojemności 1,5 ml. W przypadku próbek trzykrotnych należy użyć probówek wirówkowych o pojemności 2 ml w celu uwzględnienia luzu.
2. Przygotować główne mieszanki do uzdatniania do powtórzenia studzienek, rozcieńczając zapasy uzdatniania bezpośrednio w pożywkach bazowych OPC. Krótko zmieszaj lub delikatnie wymieszaj każdą mieszankę główną, aby zapewnić jednorodne rozprowadzenie zabiegu.
3. Przygotować 45 nM trójjodotyroniny (T₃) jako kontrolę dodatnią i odpowiedni nośnik jako kontrolę ujemną. Rozcieńczyć 10 mM T₃ w stosunku 1:1,000 w 1 ml pożywki bazowej OPC, a następnie dalej rozcieńczyć w głównej mieszance zabiegowej, aby w razie potrzeby zmniejszyć końcowe stężenie DMSO.
4. Odsysać pożywkę z dołków hodowlanych po jednej grupie poddawanej działaniu substancji na raz, aby uniknąć wysuszenia komórek. Użyj końcówki pipety o pojemności 200 μl na końcu szklanej pipety Pasteura, aby uniknąć zeskrobywania czarnego materiału z boków studzienki do kultury.
5. Powoli dodać 500 μl mieszanki głównej do zabiegu wzdłuż boku studzienki za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
6. Inkubuj kultury przez pożądany czas, wykonując pełną wymianę pożywki ze świeżymi pożywkami zabiegowymi co 2-3 dni. Rutynowo obserwujemy 30-40% MBP⁺ po 4 dniach w pożywkach różnicujących.
7. Pod koniec pożądanego okresu obróbki przygotuj świeży 4% paraformaldehyd (PFA) lub rozmroź zamrożony wywar do temperatury pokojowej. UWAGA: PFA jest niezwykle toksyczny i musi być przygotowywany w dygestorium.
8. Odessać pożywkę i powoli dodawać 400 μl PFA z boku studzienki, aby utrwalić komórki. Inkubować płytkę przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
9. Odessać PFA i powoli dodać 500 μl sterylnego buforu fosforanowego soli fizjologicznej Dulbecco (D-PBS, z Ca²⁺ i Mg²⁺) z boku studzienki, aby przepłukać komórki. Powtórz pranie w sumie jeszcze dwa razy. Nie zasysaj końcowego prania.
10. Owinąć płytkę w parafolię i przechowywać w temperaturze 4 °C do późniejszej obróbki lub przejść bezpośrednio do następnego etapu. Talerze można przechowywać przez kilka tygodni.

3. Immunocytochemia i kwantyfikacja zasadowego białka mieliny

Uwaga: Podczas wykonywania procedur obchodzenia się z cieczą na płytkach 24-dołkowych zaleca się szybką pracę, aby uniknąć wysuszenia komórek. W tym przypadku zaleca się stosowanie wielokanałowego aspiratora próżniowego i pipety wielokanałowej.

1. Doprowadź płytkę do temperatury pokojowej, odessaj studzienki i dodaj 250 μl D-PBS (z Ca²⁺ i Mg²⁺) zawierające 0,1% Triton X-100 i 5% normalnej surowicy koziej (NGS). Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, delikatnie wstrząsając orbitalnie.
2. Przygotować podstawowy roztwór do inkubacji, rozcieńczając mysie przeciwciało monoklonalne anty-MBP 1:1,000 i królicze przeciwciało poliklonalne anty-aktyny 1:200 w D-PBS (z Ca²⁺ i Mg²⁺) zawierające 5% NGS. Alternatywnie, poliklonalny anty-Olig2 królika w stosunku 1:1,000 może być stosowany do normalizacji specyficznej dla oligodendrocytów w mieszanych kulturach glejowych. Przygotuj wystarczającą ilość roztworu pierwotnego, aby pomieścić 250 μl na studzienkę.
3. Inkubować przeciwciała pierwszorzędowe w temperaturze 4 °C przez noc przez 16-18 godzin, delikatnie wstrząsając orbitalnie.
4. Odessać pierwotny roztwór inkubacyjny i przemyć komórki 3 x 10 min 500 μl D-PBS (z Ca²⁺ i Mg²⁺) w temperaturze pokojowej z delikatnym wytrząsaniem orbitalnym.
5. Myjąc płytkę, przygotować wtórny roztwór inkubacyjny, rozcieńczając przeciwciała anty-mysie 680 i anty-królicze 800 w stosunku 1:500 w D-PBS (z Ca²⁺ i Mg²⁺) zawierających 5% NGS. Przygotowując ten roztwór, zminimalizuj ekspozycję na światło otoczenia.
6. Odessać ostatnie płukanie i dodać 250 μl wtórnego roztworu do inkubacji. Chronić płytkę przed światłem i inkubować ją w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę z delikatnym potrząsaniem orbitalnym.
7. Zassać wtórny roztwór inkubacyjny i przemyć studzienki 3 x 10 minut 500 μl D-PBS (z Ca²⁺ i Mg²⁺) w temperaturze pokojowej z delikatnym wytrząsaniem orbitalnym.
8. Zeskanuj płytkę za pomocą systemu obrazowania zdolnego do wykrywania emisji fluorescencji 700 nm i 800 nm. Jako punkt wyjścia ustaw przesunięcie ogniskowej na 3 i czułość na 1,5 dla MBP, 5,0 dla aktyny i 3,5 dla Olig2. Dostosuj wartości czułości zgodnie z potrzebami, aby uniknąć prześwietlenia sygnału.
9. Określ ilościowo zakres oligodendrogenezy za pomocą półautomatycznych metod opartych na oprogramowaniu.
   1. Za pomocą oprogramowania ustaw tryb analizy płyt na "24 odwierty" i wyrównaj okręgi wokół zewnętrznego obwodu zeskanowanych studni. Ustaw kanał normalizacji na "800" i wyeksportuj całkowitą i względną intensywność fluorescencji dla kanałów 700 nm (MBP) i 800 nm (Olig2/Actin).
   2. Podzielić intensywność przy 700 nm przez intensywność przy 800 nm, aby uzyskać znormalizowaną ekspresję MBP we względnych jednostkach fluorescencji. Obliczyć średnią z powtórzonych pomiarów i przeskalować wyrażenie do kontrolek dnia 0 +PDGF zgodnie z potrzebami analizy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Culture Materials
PDGF-AA	PeproTech Inc	100-13A	20 ng/ml
Sultirotek dimetylu	Sigma-Aldrich	D2650	Hybri-Max 100 mL
Trijodotyronina	Sigma-Aldrich	T6397	45 nM
Fumaran klemastynu salt	Sigma-Aldrich	SML0445-100MG	1 μM
Sól hemifumaranu kwetiapiny	Sigma-Aldrich	Q3638-10MG	1 μM
N-acetylocysteina	Sigma-Aldrich	A9165	5 μg/mL
Progesterone	Sigma-Aldrich	P8783	60 ng/ml
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P1524	10 μg/mL
Putrecine	Sigma-Aldrich	P7505	16 μg/mL
Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S5261	40 ng/mL
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0135	50 ng/mL
d-Biotin	Sigma-Aldrich	B4639		Insulina	Sigma-Aldrich	I6634	5 μg/mL
Apo-Transferrin	Sigma-Aldrich	T1147	100 μg/mL
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma-Aldrich	A4161	100 μg/mL
Trace elements B	Corning	25-022-Cl	1 x
B-27 Supplement	Life Technologies	17504044	1 x
Penicylina/Streptomycyna	Life Technologies	15140122	1 x
DMEM	Life Technologies	11995-065	1 x
24-well Black Visiplate z pokrywką	Perkin Elmer	1450-605	Klasa hodowli tkankowej
Immunocytochemia i kwantyfikacja
PFA	Sigma-Aldrich	100-13A	4%
Triton X-100	Sigma-Aldrich	78787	0.10%
Normal Goat Serum	Jackson Immuno Research	005-000-121	5%
mouse monoklonalny anty-MBP	Biolegend	SMI-99P	1:1000 Rozcieńczenie
poliklonalny anty-aktyna	Santa Cruz Biotecnology	SC-7210	1:200 Rozcieńczenie
królik poliklonalny anty-Olig2	Millipore	AB9610	1:1000 Ditution
kozia anty-mysz 680RD	Licor	926-68070	1:500 Dilution
kozioł anty-królik 800CW	Licor	926-32211<
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse	Life Technologies	A11032	1:000 dilution
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit	Life Technologies	A11008	1:000 rozcieńczenie
Przedłuż złoty antifade za pomocą DAPI	Life Technologies	P36931
DPBS with Ca2+ and Mg2+	Corning	21-030-CV
Licor Odyssey Clx Infared Imaging System	Licor

td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>1:500 Dilution