Wizualizacja mitochondriów w śródnaskórkowych włóknach nerwowych

Streszczenie

Źródło: Hamid, H. S., et al. Trójwymiarowe obrazowanie i analiza mitochondriów w obrębie śródnaskórkowych włókien nerwowych człowieka. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film przedstawia metodę wizualizacji mitochondriów specyficznych dla nerwów za pomocą obrazowania trójwymiarowego. Przedstawiono w nim proces pozyskiwania sekwencyjnych skanów wstępnie znakowanych śródnaskórkowych włókien nerwowych i generowania obrazów powierzchni 3D w celu wyizolowania i wyświetlenia mitochondriów w odniesieniu do struktur nerwowych.

Protokół

Wszystkie procedury związane z pobraniem próbki zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.

1. Obrazowanie konfokalne

1. Wykonaj obrazowanie konfokalne:
   1. Zbieraj obrazy za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego z 40-krotnym obiektywem olejowym (1,25 apertury numerycznej (NA)) na odwróconym mikroskopie.
      1. Na każdej płaszczyźnie ogniskowej sekwencyjnie odbieraj sygnały fluorescencyjne:
         Włókna nerwowe: wzbudzenie λ= 488 nm, filtr emisji widmowej λ = 505 - 560 nm
         Mitochondria: wzbudzenie λ = 543 nm, filtr emisji widmowej λ= 606 - 670 nm
   3. Ustaw oprogramowanie mikroskopu na zoptymalizowaną rozdzielczość boczną (rozdzielczość skanowania = 1,024 x 1,024) i rozdzielczość osiową/przekrój optyczny (apertura konfokalna = 1 jednostka przewiewna (AU) o rozmiarze kroku z 210 nm).
      UWAGA: Wynikowa rozdzielczość XYZ to 172,2 nm x 172,2 nm x 210 nm przy rozmiarze obrazu 176,1 μm x 176,1 μm x 30-50 μm.
2. UWAGA: Czas skanowania z powyższymi parametrami trwa około 20 - 40 min, w zależności od liczby z-slices.

2. 3D Wizualizacja i analiza mitochondriów w obrębie śródnaskórkowych włókien nerwowych człowieka

1. Izoluj naskórek 3D:
   1. Zduplikuj oryginalny obraz i użyj projekcji maksymalnej intensywności (rozszerzony widok ostrości) obrazu, aby zidentyfikować i wyizolować naskórek.
   2. Użyj dekonwolucji na nerwach i mitochondrialnych sygnałach fluorescencyjnych:
      NOTE:
   3. Oblicz funkcję rozproszenia punktów (PSF) dla zielonego fluorescencyjnego sygnału nerwowego (green-fluorescence) z następującymi parametrami:
      2. Ustaw obliczony PSF na confocal. Ustaw średni współczynnik załamania światła na 1,515, a aperturę numeryczną na 1,25. Ustaw otwór detektora na 1 AU. Ustaw długość fali wzbudzenia laserowego na 543 nm, a długość fali emisji na 617 nm.
   4. Utwórz powierzchnie specyficzne dla nerwów:
      1. Użyj narzędzia "utwórz powierzchnię", aby stworzyć solidną powierzchnię nerwów z dekonwoluowanego zielono-fluorescencyjnego wtórnego znakowania produktu genu białka 9.5 (PGP9.5) zidentyfikowanych nerwów.
      2. UWAGA: Jeśli to konieczne, ręcznie edytuj dodatkowe powierzchnie nienerwowe w zakładce "Edycja", przytrzymując klawisz CONTROL, aby podświetlić wiele obiektów, a następnie usuwając je za pomocą klawisza Delete.
   5. Wyizoluj specyficzny dla nerwów fluorescencyjny sygnał mitochondrialny:
      1. Wybierz zakładkę Edytuj powierzchni nerwu, aby wyświetlić funkcję "Właściwości maski". Utworzona powierzchnia nerwu służy do izolowania mitochondriów w tych nerwach z dala od sygnałów mitochondrialnych związanych z keratynocytami.
      2. Utwórz powierzchnie specyficzne dla mitochondriów:
         1. Użyj narzędzia "create surface", aby stworzyć solidną powierzchnię mitochondriów z nowo utworzonego kanału fluorescencyjnego sygnałów mitochondrialnych specyficznych dla nerwów.
         2. UWAGA:

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny Leica SP5	Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL	SP5
Oprogramowanie Volocity x64	Perkin Elmer, Waltham, MA	Wersja 4.4.0	Do przetwarzania obrazu wykorzystywane jest oprogramowanie Volocity
Oprogramowanie do analizy 3D Imaris x64{{TAG_ 31}}	Bitplane, Concord, MA	Wersja 7.7.1	Do analizy obrazu służy oprogramowanie Imaris