Obrazowanie wapnia ex vivo w celu zbadania reakcji mózgu Drosophila na neuropeptydy

Streszczenie

Źródło: Ishimoto, H. et. al.,, Obrazowanie wapnia ex vivo do wizualizacji reakcji mózgu na sygnalizację endokrynologiczną u Drosophila. J. Vis. exp. (2018)

Ten film przedstawia obrazowanie wapnia do badaniaDrosophila reakcje mózgu na neuropeptydy. Neurony wyrażające fluorescencyjny wskaźnik wapnia ujawniają wewnątrzkomórkową dynamikę wapnia i funkcjonalne odpowiedzi na cząsteczki sygnałowe.

Protokół

1. Przygotowanie eksplantatów mózgu larw

1. Zrób komorę obrazowania.
   UWAGA: Stabilny zapis wymaga, aby eksplantaty mózgu były na uwięzi. W tym przypadku zastosowano tanią, ręcznie wykonaną komorę obrazowania w systemie obrazowania Ca²⁺.
   1. Za pomocą kleszczy podrap dolną środkową część plastikowej naczyń hodowlanej (35 mm x 10 mm), aby zrobić wgniecenie w brzusznym zwoju mózgu larwy, ułatwiając montaż (krok 1.3, Rysunek 1).
   2. Za pomocą wykałaczki umieść małą kroplę superglue po obu stronach wgniecenia i przymocuj pręt wolframowy (średnica 0,125 mm, długość od 6 do 7 mm) do kleju.
   3. Za pomocą małego kawałka kleju wielokrotnego użytku przypominającego szpachlę wykonaj okrągłą ściankę (o średnicy 10 mm i wysokości 3 mm) otaczającą wgłębienie (Rysunek 1).
      UWAGA: Przestrzeń wewnątrz ściany zostanie później wypełniona solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS; 0,14 M chlorek sodu ( NaCl), 0,0027 M chlorek potasu ( KCl), 0,01 M jon fosforanowy (PO4^3–), pH 7,4 ± 0,05 w 25 °C).
2. Przygotowanie zwierząt
   UWAGA: W przypadku obrazowania wapnia wskaźnik wapnia, GCaMP6s, jest wyrażany w typie komórki będącym przedmiotem zainteresowania, co zwykle uzyskuje się przy użyciu kombinacji specyficznych tkankowo GAL4 i UAS-GCaMP6s. Aby zapewnić, że sygnał jest przekazywany przez receptor kandydujący, GCaMP6s ulega również ekspresji w zmutowanym wadliwym receptorze.
   1. Gdy wymagane są porównania eksperymentalne dla różnych genotypów, takich jak dziki typ i mutanty, badaj larwy w teście wieku, aby uniknąć wahań poziomu ekspresji GCaMP6 i różnic fizjologicznych spowodowanych etapami rozwoju.
   2. Muchy rodzicielskie (po 30 much każdej płci) należy przechowywać w fiolce hodowlanej zawierającej standardowy pokarm dla much przez 8 godzin, aby umożliwić składanie jaj na powierzchni pokarmu. Hodowla larw w masie w 12-godzinnym cyklu jasno-ciemnym w temperaturze 25 °C i wilgotności względnej 60–70 %.

3. Sekcja mózgu larwy
   1. Po 90-120 godzinach od złożenia jaj (AEL) zbierz larwy i umyj je co najmniej 3 razy wodą destylowaną, aby usunąć przylegające resztki jedzenia.
   2. Umieść larwę na kwadratowym 1,5-calowym szkiełku zegarkowym wypełnionym lodowatym PBS.
      UWAGA: Następne dwa kroki wykonuje się w tym szkiełku zegarkowym pod mikroskopem preparacyjnym.
   3. Użyj kleszczy, aby delikatnie chwycić środkową część larwy. Użyj innych kleszczy, aby chwycić haczyki do ust i delikatnie pociągnij haczyki do ust, aby oddzielić przednią część larwy zawierającej mózg od reszty ciała.
      UWAGA: Alternatywnie można użyć nożyczek chirurgicznych.
   4. Przytrzymaj przedni koniec kleszczami i odwróć larwę na lewą stronę. Usuń obce tkanki przyczepione do mózgu, takie jak dyski wyobrażeniowe, ciała tłuszczowe i gruczoły pierścieniowe. Delikatnie oddziel mózg od aparatu gębowego.
   5. Nanieść 200 μl PBS na wnętrze pierścienia wykonanego z kleju wielokrotnego użytku przypominającego szpachlę w komorze obrazowania. Delikatnie zassać wypreparowany mózg za pomocą PBS do pipety Pasteura, a następnie przenieść go do komory obrazowania.

4. Umieszczanie mózgu w komorze obrazowania
   1. Użyj kleszczy, aby chwycić włókna mięśniowe wystające z brzusznych zwojów. Delikatnie włóż mózg do wgłębienia pod drutem wolframowym.
   2. Za pomocą innych kleszczy pociągnij drut wolframowy lekko do góry, aby ustawić mózg w prawidłowej pozycji do obrazowania (Rysunek 1).

2. Przejęcie ca²⁺} obrazów fluorescencyjnych

UWAGA: Eksplantaty mózgu zanurzone w PBS są obrazowane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w soczewkę obiektywową 20X zanurzoną w wodzie (apertura numeryczna, Nie dotyczy = 0,5). PBS nie aktywuje komórek w mózgu. Jeśli potrzebne są obrazy w osi Z, soczewka obiektywu jest montowana za pomocą ruchomego obiektywu aktywowanego piezoelektrycznie. Głowica konfokalna z obracającym się dyskiem służy do zwiększenia rozdzielczości czasowej. W przypadku obrazowania przy słabym oświetleniu na mikroskopie zamontowana jest kamera z urządzeniem sprzężonym z ładunkiem zwielokrotnionym elektronami. Obrazowanie fluorescencji GCaMP6s (wzbudzenie/emisja: 488/509 nm) wymaga lasera o długości fali 488 nm do wzbudzenia z dichroicznym rozdzielaczem wiązki i filtrem emisyjnym (e.g{., 528 ± filtr pasmowo-przepustowy 38 nm).

1. Umieść komorę obrazowania zawierającą eksplantat mózgu pod mikroskopem.
2. Opuść soczewkę obiektywu, aż dotknie PBS. W świetle jasnego pola ustaw mózg i ustaw go w ostrości. Przełącz się na światło fluorescencyjne i dostosuj ostrość na komórkach oznaczonych GCaMP6s.
   UWAGA: Podstawowa zielona fluorescencja GCaMP6 powinna być widoczna.
3. Rozpocznij akwizycję z prędkością 250 ms/klatkę w rozdzielczości 512 × 512 pikseli w trybie chłodzonym wodą za pomocą odpowiedniego oprogramowania do akwizycji (e.g{., μManager). Dostosuj czas ekspozycji, aby uzyskać wartości fluorescencji w zakresie dynamicznym kamery z urządzeniem sprzężonym z ładunkiem (CCD), ale nie mniej niż 1000 (dowolne jednostki), z obrazami 16-bitowymi (zakres dynamiczny 0-65 535).
   UWAGA: Należy użyć niskiego czasu naświetlania, aby zminimalizować fotowybielanie GCaMP6s. Czas ekspozycji powinien być zoptymalizowany w każdym eksperymencie, ponieważ zależy od poziomów ekspresji GCaMP6 i czułości systemu detekcji. W naszym eksperymencie z użyciem dilp2>GCaMP6s. Gdy dla danej głębokości obrazowania wymagane są przekroje z, można uzyskać kilka obrazów przekroju z w zależności od czasu ekspozycji i interwałów klatek. Jeśli kamera ma wystarczającą rozdzielczość przestrzenną, rozmiar binningu (liczba rejestrów na chipie, które zostaną połączone w jeden piksel cyfrowy) powinien zostać zwiększony, aby skrócić czas naświetlania.
4. Po określeniu parametrów obrazowania wykonuj zdjęcia przez 1 minutę przed podaniem peptydu, aby wykryć wyjściowe natężenie sygnału (F₀).
5. Zastosować peptyd testowy; w tym celu rozpuść 100 μl roztworu peptydu w PBS i pipetuj go bezpośrednio do kąpieli larwalnej, aby uzyskać optymalne stężenie.
   UWAGA: Roztwór peptydu należy wstrzykiwać powoli (e.g., szybkość przepływu 20 μL/s) do roztworu kąpieli za pomocą pipety. Niepowiązany syntetyczny peptyd rozpuszczony w PBS jest stosowany jako kontrola ujemna.
6. Rejestruj emisję GCaMP6s przez kilka minut.

Wyniki

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pręt wolframowy	A-M systems, Sequim, WA, USA	717000
Blu Tack	Bostik, Paryż, Francja	3049100	Kleje szpachlowe wielokrotnego użytku
}Szkło do zegarków, kwadrat, 1 5/8 cala	Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA	742300
PBS	TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japonia	T900	Fosforany buforowane sole
CCHa2	SCRUM Inc., Tokio, Japonia		Peptyd syntetyzowany w Kustumie
Ghrerin	Peptide institute Inc., Osaka, Japonia	4372-s
Nociceptin	Peptide institute Inc., Osaka, Japonia	4313-v
Axio Imager A2	Carl Zeiss, Oberkochen, Niemcy	Axio Imager A2	Mikroskop fluorescencyjny
Obiektyw W N-Achroplan 20x/0.5 M27	Carl Zeiss, Oberkochen, Niemcy	420957-9900-000	Soczewka obiektywowa zanurzająca w wodzie
P-725 Skaner obiektywowy PIFOC o dużym zasięgu ruchu	Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Niemcy	N/A	Piezoelektryczny napęd do soczewek
Skaner konfokalny CSU-W1	Yokogawa Electric Korporacja, Tokio, Japonia	CSU-W1	Głowica konfokalna z wirującym dyskiem
ImagEM C9100-13	Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japonia	C9100-13	Kamera EM-CCD
OBIS 488 nm LS 60 mW	Spójny, Santa Clara, CA, USA	1178770	488-nm laser
{{}}488/568/647 nm Yokogawa dichroic beamsplitter	Semrock, Rochester, NY, USA	Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5	Rozdzielacz wiązki dichroicznej
528/38 nm jednozakresowy filtr pasmowoprzepustowy BrightLine	Semrock, Rochester, NY, USA	FF01-528/38-25	Filtr emisji
μManager	Open Imaging, Inc.	N/A	https://micro-manager.org