$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.
1. Ekstrakcja, sekcja i przygotowanie tkanek mózgu
- {{}}Poświęc szczep myszy typu dzikiego C57BL/6 poprzez głęboką eutanazję za pomocą CO2 uduszenie przez 5 minut. Upewnij się, że śmierć nastąpiła w wyniku zwichnięcia szyjki macicy.
- Wyczyść głowę myszy 70% etanolem.
- Wykonaj kraniektomię za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczy, najpierw ściągając skórę, zaczynając od czubka głowy, aby odsłonić czaszkę.
- Następnie, gdy czaszka jest odsłonięta, usuń czaszkę, obierając kość kawałek po kawałku, zaczynając od tylnej strony i przesuwając się w kierunku przedniej strony. Uważaj, aby nie zniszczyć komór mózgu.
- Zbierz cały mózg.
- Umieścić mózg na 100-milimetrowej szalce Petriego zawierającej zmodyfikowaną pożywkę Dulbecco Eagle's Medium (DMEM)/High-Glucose uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% roztworem penicyliny/streptomycyny zawierającym 10 000 jednostek/ml penicyliny i 10 000 μg/ml streptomycyny i wstępnie podgrzanym do 37 °C.
- Ręcznie pokrój mózg na środkowej płaszczyźnie strzałkowej za pomocą Ostre ostrze i użyj wibratomu, aby uzyskać pierwszy przekrój 100-200 mm z każdej połowy.
- Przepłukać tkankę mózgową wstępnie podgrzanym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami o temperaturze 37 °C (1x PBS).
- Natychmiast umieść sekcję mózgu w pożywce DMEM/High-Glucose podgrzanej do 37 °C.
2. Konfiguracja i konfiguracja obrazowania na żywo
- Umieść skrawki tkanki mózgowej w 30-milimetrowych naczyniach hodowlanych ze szklanym dnem zawierających 1 ml pożywki DMEM/High-Glucose Systems. Dostosuj środowisko zamkniętej komory mikroskopu do 37 °C, 95%/5% O2/CO2 (Rysunek 1).
- Używając soczewki immersyjnej z olejkiem 60X, zbierz obrazy komórek wyściółki/rzęsek, umieszczając kroplę oleju na soczewce obiektywu 60X i skupiając się na komórkach o regularnym kontraście interferencyjnym (DIC) przechodzącym światło.
- Następnie postępuj zgodnie z kierunkiem ruchu pęcherzyków DMEM jako wskazówką do lokalizacji ruchliwych rzęsek wyściółki, ponieważ uderzenia rzęsek tworzą rodzaj ruchu pęcherzyków w okolicy. Wybierz obszar zawierający zdrowe komórki z ruchliwymi rzęskami w bocznej komorze mózgu za pomocą filtra DIC. Po znalezieniu rzęsek wyściółki dostosuj światło i skup się, aby uzyskać zadowalający obraz.
- Korzystając z oprogramowania do obrazowania Metamorph, ustaw parametry obrazowania na żywo zgodnie z określonym celem. W tej demonstracji uzyskaj dwudziestoczterobitowe obrazy z binningiem kamery ustawionym na 1 x 1 w połączeniu z obiektywem 60X i czasem naświetlania 5-10 ms.
- Zbierz obrazy DIC, otwierając aperturę mikroskopu do optymalnego poziomu, aby uzyskać minimalny czas ekspozycji. Obserwuj obrazy na żywo przesyłane strumieniowo do kamery, aby zapewnić szybkie i natychmiastowe pozyskiwanie obrazu bez opóźnień. Oblicz szybkość bicia rzęsek w oparciu o wymóg minimalnych czasów naświetlania, aby uzyskać wystarczający kontrast obrazu.
