$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.
1. Przygotowanie tkanki mózgowej i obrazowanie SBFSEM
- }Znieczulenie młodej (~2 - 4 miesiące) czarnej myszy C57 (szczep C57BL/6J) za pomocą 4 - 5% izofluranu zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Potwierdź znieczulenie, monitorując utratę napięcia mięśniowego, brak dobrowolnych ruchów i reakcje na bodźce awersyjne, takie jak szczypanie ogona.
- Przypnij mysz do tacki preparacyjnej i wykonaj nacięcie na skórze wzdłuż brzusznej linii środkowej. Wykonaj dalsze nacięcia w skórze, aby odsłonić klatkę piersiową myszy. Naciąć przeponę, ostrożnie wypreparować jamę klatki piersiowej wzdłuż obwodu, aby odsłonić bijące serce, a następnie wykonać nacięcie na prawym przedsionku.
- Za pomocą kaniuli motylkowej kanuluj lewą komorę. Wykonać perfuzję myszy przezskórnie przy użyciu 10 - 20 ml buforu fosforanowego soli fizjologicznej (PBS) o pH 7,2, aż do potwierdzenia wykrwawienia przez zmianę koloru wątroby.
Uwaga: Zmiana koloru wątroby służy jako wskazówka do określenia stopnia wykrwawienia. Upewnij się, że kolor wątroby zmienia się z czerwonawo-brązowego na bladoróżowy. - Perfuzję myszy przeszyderczo za pomocą 10 - 20 ml 2% aldehydu glutarowego i 4% paraformaldehydu wykonanego w 0,10 M buforze kakodylowym (pH 7,2), aby szybko utrwalić tkankę mózgową od wewnątrz. Fiksacja jest monitorowana poprzez obserwację usztywnienia ogona.
Uwaga: Przygotować 0,10 M bufor kakodylowy (pH 7,2) rozpuszczając 2,14 g kakodylanu sodu w 80 ml wody, dodać kwas solny w celu dostosowania pH i zwiększyć objętość do 100 ml wodą. - Po perfuzji odetnij głowę myszy, wypreparuj mózg, a następnie utrwal w 0,10 M buforze kakodylanu sodu (pH 7,2) zawierającym 2% aldehydu glutarowego i 4% paraformaldehydu przez 48 godzin w 4 oC.
- Po 48 godzinach wykonaj 400 μm przekroje koronalne za pomocą wibratomu, a następnie ostrożnie wypreparuj obszar interesujące w mózgu (na przykład hipokamp) pod mikroskopem preparacyjnym. Ostrożnie przytnij tkankę i zrób zdjęcie, aby zachować orientację.
Uwaga: Metody postprocessingu barwienia tkanek w SBFSEM łączą w sobie różne metody barwienia metali ciężkich w celu poprawy rozdzielczości. . - Przemyć tkanki utrwalone aldehydem glutarowym 3 razy po 5 minut każda w 0,1 M buforze kakodylowym (pH 7,2).
- Przygotować 0,1% roztwór kwasu garbnikowego, rozpuszczając kwas garbnikowy w 0,1 M buforze kakodylanu sodu (pH 7,2). Obracać aż do rozpuszczenia i w razie potrzeby przefiltrować przez filtr 0,45 μm.
- Po utrwaleniu tkanek kakodylanem buforowanym 0,1% kwasem garbnikowym, inkubując w 1 ml odczynnika przez 30 - 60 minut w temperaturze RT.
Uwaga: Czas inkubacji zależy od wielkości tkanki, ale 30 minut działa najlepiej w przypadku większości tkanek. - Umyj chusteczki 3 razy po 5 minut w buforze kakodylowym (pH 7,2).
- Rozpuścić 0,3 g żelazocyjanku potasu i 0,86 g kakodylanu sodu w 10 ml destylowanego H2O (dH2O). Roztwór żelazocyjanku potasu należy przechowywać na lodzie. Tuż przed użyciem dodać 10 ml 4% tetratlenku osmu (OsO4).
- Tkanki barwić 2% roztworem żelazocyjanku osmu przez 90 minut na lodzie. Umyć 3 razy po 5 minut w dH2O.
- {{}}Przygotować 1% roztwór tiokarbohydrazydu (TCH), rozpuszczając 0,1 g TCH w 10 ml dH2O. Rozpuścić w temperaturze 60 °C, mieszając co 10 minut, aż do całkowitego rozpuszczenia. Przestrzegać środków ostrożności podczas obchodzenia się z TCH, szczególnie uważając, aby nie używać metali, podgrzewać do wysokich temperatur lub dopuszczać do wyschnięcia roztworu.
- Próbki należy traktować świeżo przygotowanym 1% TCH przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Umyć 3 razy po 5 minut w dH2O.
- Rozcieńczyć 4% OsO4 do 2% z dH2{{TAG_ 196}}O, i zabarwić tkanki 2% wodnym tetratlenkiem osmu przez inkubację przez 1 godzinę. Umyj chusteczki 3 razy po 5 minut za pomocą dH2O.
- {{}}Inkubuj próbki O/N w 1% octanie uranylu w dH2O przy 4 °C.
- {{TAG_ Przygotować roztwór asparaginianu ołowiu Waltona.
- Rozpuścić 0,998 g L-asparaginianu w 250 ml dH2O, a następnie dodać 10 N wodorotlenku potasu (KOH) kroplami, aż pH osiągnie 5,5. Po dostosowaniu pH dodać 0,066 g azotanu ołowiu do 10 ml bulionu z kwasu asparaginowego i podgrzewać do 60 °C przez 30 minut.
- Opłucz tkanki w dH2O i inkubować z barwnikiem asparaginianu ołowiu Waltona przez 30 minut w piekarniku o temperaturze 60 °C. Umyć 3 razy po 5 minut w dH2O.
- {{}}Odwodnić próbki za pomocą stopniowanej serii alkoholi przy użyciu schłodzonych roztworów 20%, 50%, 75%, 85% i 95% etanolu przez 5 minut każda, następnie 100% etanol 3 razy po 10 minut.
Uwaga: Używaj 100% etanolu ze świeżo otwartych butelek, ponieważ otwarty etanol pochłania wodę z powietrza i powoduje niepowodzenie zatapiania. Konieczne będą dłuższe inkubacje w przypadku większych próbek tkanek. - Próbki należy przemyć 2 razy po 15 minut w tlenku propylenu.
- Wykonaj żywicę do zatapiania w tworzywach sztucznych, używając 25 ml żywicy, 10,5 ml DDSA (bezwodnik bursztynowy dodecenylu), 15,5 ml NMA (bezwodnik metylowy nady) i 1 ml DMP-30 (2,4,6-Tris dimetyloaminometylofenol). Wymieszaj żywicę, potrząsając. Odwiruj i odstaw żywicę, aż bąbelki się rozpuszczą.
Uwaga: To jest standardowy przepis na średnią twardość. Można stosować inne rodzaje żywic z tworzywa sztucznego do mikroskopii elektronowej (EM), ale należy je wcześniej przetestować z nieistotną próbką kontrolną, ponieważ nie wszystkie żywice działają w przypadku SBFSEM. - Inkubować tkanki O/N w mieszance 50: 50 żywicy zatapiającej i tlenku propylenu w fiolce, która jest początkowo zakryta i odsklepiona po 2 godzinach, tak aby tlenek propylenu odparował w okresie około 8 - 10 godzin.
- Przenieś tkanki do 100% świeżej żywicy do zatapiania w czystych fiolkach przez 2 godziny.
{{TAG_ 306}}Zanurz próbki w świeżej żywicy do zatapiania, w płaskich formach zawierających wydrukowane etykiety papierowe i utwardź je w piecu w temperaturze 60 °C przez 48 godzin. Po około 1 godzinie ponownie sprawdź ułożenie i wyrównanie tkanek i wyreguluj w razie potrzeby. - Przytnij próbki do obszaru zainteresowania i zamontuj je na aluminiowym kołku za pomocą żelującego kleju cyjanoakrylowego lub przewodzącej żywicy epoksydowej. Następnie pokryj boki bloku koloidalną pastą srebrną, aby zapewnić przewodzącą ścieżkę do aluminiowego kołka.
- Badaj próbki tkanek za pomocą systemu skaningowego mikroskopu elektronowego wyposażonego w umieszczony w komorze stolik ultramikrotomu i detektor elektronów wstecznie rozproszonych o niskim napięciu kV.
Uwaga: Zdobądź szkolenie w zakresie korzystania ze skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) i zostań autoryzowanym użytkownikiem. Alternatywnie możliwa może być współpraca z naukowcem lub ośrodkiem centralnym w przypadku małych projektów. Szkolenie w zakresie promieniowania może być również wymagane, ponieważ SEM generują promieniowanie rentgenowskie. - Aby zobrazować próbki, należy użyć następujących ustawień: 2,25 kV, przy rozdzielczości 5 - 10 nm/piksel, z rozmiarami pola od 80 do 250 μm w x,y (możliwe inne rozmiary pola) i grubość warstwy 50 - 100 nm, z łączną liczbą 250 - 600 warstw w okresie 16 - 20 godzin.
Uwaga: Ustawienia różnią się znacznie w zależności od różnych mikroskopów, poszczególnych próbek i pożądanej rozdzielczości. Dzięki tym ustawieniom powstaną obrazy, które będą łatwe do zinterpretowania dla wielu próbek.
2. Analiza zestawu danych obrazowania
Uwaga: Oprogramowanie Image J/Fiji służy do analizy zestawu danych i opiera się na wtyczce TrakEM2. Etapy wstępnego przetwarzania mogą być wykonywane przy użyciu różnych programów i mogą być obszerne lub niewielkie, w zależności od poziomu doświadczenia i uzyskanych stosów. Główne transformacje przy użyciu oprogramowania open source (ImageJ ver 1.50b, FIJI download Oct 1, 2015) są opisane tutaj.
- Konwertuj obrazy do 8-bitowego formatu tiff z oryginalnych, zastrzeżonych obrazów 16-bitowych, otwierając oprogramowanie i wybierając pozycje menu Image→Type→8 bit.
- Jeśli automatyczna konwersja kontrastu/jasności na tym etapie nie jest idealna dla obrazów, otwórz ponownie obrazy 16-bitowe i naciśnij Image→Adjust→Brightness/Contrast. Wybierz zakres, który działa dla wszystkich obrazów, a następnie naciśnij przycisk Zastosuj. Następnie wykonaj konwersję. Uwaga: W przypadku niektórych SEM ten krok może wymagać oprogramowania producenta mikroskopu.
- Jeśli jest to wymagane, z powodu niedopuszczalnego ruchu obrazu między plasterkami (e.g{. dryf z powodu ładowania), zarejestruj/wyrównaj stosy obrazów (pozycje menu Plugins→Registration→Linear StackAlignmentWithSIFT). W większości programów rejestracyjnych ustawia się tryb "tylko tłumaczenie", a nie "sztywny korpus".
Uwaga: Wiele podejść i oprogramowania może działać: wtyczka rejestracyjna SIFT działa dla wielu aplikacji i istnieje wersja wirtualnego stosu. - W razie potrzeby powiększ rozmiar płótna przed rejestracją (Image→Adjust→CanvasSize) lub zmniejsz go do obszaru zainteresowania (Image→Crop).
Uwaga: Może wystąpić pewien dryf lub rozchylenie, a wypróbowanie innych wtyczek lub oprogramowania może przynieść lepsze wyniki. Dostępne są również opcje ręczne (e.g. ImageJ/FIJI, Wtyczki→Rejestracja→ManualLandmarkSelection).
- W razie potrzeby przeskaluj obrazy do mniejszego, łatwiejszego w obsłudze rozmiaru (e.g{. 25%) za pomocą ImageJ (Image→Scale).