Identyfikacja podtypów komórek zwojowych siatkówki myszy za pomocą śledzenia fluorescencyjnego

Streszczenie

Źródło: Laboissonniere, et. al. Jednokomórkowy sekwencjoner RNA zdefiniowanych podzbiorów komórek zwojowych siatkówki. J. Vis. exp. (2017).

Ten film demonstruje technikę fluorescencyjnego śledzenia w celu identyfikacji podtypów komórek zwojowych siatkówki (RGC) w transgenicznej siatkówce myszy. Proces ten polega na zabezpieczeniu izolowanej siatkówki w komorze rejestracyjnej, utrzymaniu żywotności komórek za pomocą natlenionej perfuzji i celowaniu w znakowane fluorescencyjnie RGC za pomocą pipety ze znacznikiem. Analizując morfologię i stratyfikację dendrytyczną, metoda umożliwia klasyfikację odrębnych podtypów RGC.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią ocenę etyczną zwierząt.

1. Przygotowanie tkanki siatkówki (2 h)

UWAGA: Wszystkie procedury opisane w tej sekcji powinny być wykonywane przy słabym czerwonym oświetleniu

1. Zwierzęta przystosowane do ciemności przez co najmniej 1 godzinę przed sekcją. Wszystkie procedury wykonuj przy słabym czerwonym oświetleniu.
2. Poddaj zwierzęta eutanazji przez uduszenie CO₂ i wyłuszczenie gałek ocznych na szalkę Petriego z wcześniej natlenionym roztworem zewnątrzkomórkowym.
3. Nakłuj rogówkę igłą i odetnij ją, przecinając ją nożyczkami okulistycznymi na granicy rogówki i twardówki.
4. Zdejmij soczewkę za pomocą kleszczyków #5. Delikatnie rozerwij twardówkę kleszczami i przeetnij nerw wzrokowy, w którym spotykają się siatkówka i twardówka. Ostrożnie zakończ usuwanie twardówki z siatkówki.
5. Usuń przezroczyste ciało szkliste za pomocą kleszczy #5; Po usunięciu ciało szkliste pojawia się jako galaretowata substancja przyklejona do kleszczy. Przekrój siatkówki na pół (tak, aby były 4 kawałki na zwierzę) i przechowuj je w natlenionym roztworze zewnątrzkomórkowym w temperaturze pokojowej do czasu użycia.
6. Gdy tkanka będzie gotowa do zamontowania w komorze rejestrującej, umieść kawałek siatkówki do inkubacji w roztworze enzymatycznym rozcieńczonym w 500 μl natlenionego roztworu zewnątrzkomórkowego. Inkubować na szalce Petriego przez 2 minuty w temperaturze pokojowej (RT) na shakerze.
   1. Umyj kawałek siatkówki w natlenionym roztworze zewnątrzkomórkowym i umieść tkankę w komorze rejestracyjnej ze szklanym dnem; Użyj plastikowej pipety transferowej z odciętą końcówką, aby umożliwić transfer siatkówki bez powodowania uszkodzenia tkanki.
7. Użyj kleszczy, aby ostrożnie spłaszczyć tkankę z warstwą fotoreceptora skierowaną w dół. Usuń nadmiar płynu za pomocą pipety. Zakotwicz tkankę za pomocą platynowego pierścienia z nylonową siatką.
   UWAGA: Metoda ta może być również wykorzystana do przygotowania tkanki do izolacji RNA ze znakowanych komórek amakrynowych i dwubiegunowych.
8. Napełnij komorę natleniznym roztworem zewnątrzkomórkowym i zamontuj go na stoliku mikroskopu. Perfuzję tkanki z natleniznym roztworem zewnątrzkomórkowym w ilości 2-4 ml / min.

3. Wizualizacja i celowanie w komórki zwojowe siatkówki GFP+ (10 min)

UWAGA: Wszystkie procedury w tej sekcji powinny być wykonywane przy słabym czerwonym oświetleniu

1. Zanim zaczniesz, wyciągnąć szklane mikropipety (średnica zewnętrzna [OD]: 1,2 mm, średnica wewnętrzna [ID]: 0,69 mm) do zapisów elektrofizjologicznych za pomocą ściągacza do mikropipet. Użyj następującego protokołu dla elektrod (należy pamiętać, że parametry należy odpowiednio dostosować, aby osiągnąć pożądaną rezystancję i będą się różnić w zależności od ściągacza i różnych szkła): Ciepło: Rampa +10; Uciąg: 0; Vel: 23; Opóźnienie: 1; Ciśnienie: 500; Pętla programu: 5 razy. Upewnij się, że końcówki mają średnicę ~1 μm, z rezystancją 2-4 MΩ dla dużych komórek i 5-7 MΩ dla mniejszych komórek.
2. Obserwuj warstwę komórek zwojowych za pomocą optyki kontrastu różnicowego w podczerwieni (IR-DIC) (Rysunek 1A). Zidentyfikuj białko zielonej fluorescencji (GFP) + komórki zwojowe siatkówki (RGC) za pomocą epifluorescencji (~480 nm) (Figura 1B).
3. Zlokalizuj pipetę wypełnioną roztworem wewnątrzkomórkowym w DIC. Zastosuj lekkie nadciśnienie i zerowe przesunięcia napięcia na amplifier.
4. Dociśnij szklaną mikropipetę do kuwety GFP+ i zastosuj podciśnienie, aby utworzyć uszczelnienie GΩ między pipetą a błoną komórkową. Zastosuj kroki polecenia napięcia testowego (e.g., 5 mV), aby monitorować rezystancję uszczelnienia. Po utworzeniu stabilnego uszczelnienia rozerwij membranę, stosując krótkie impulsy podciśnienia, aby uzyskać dostęp do całej komórki.
5. Odczekaj 1-2 minuty, aż dendryty komórki wypełnią się znacznikiem fluorescencyjnym.
   UWAGA: Komórkę można morfologicznie typować, badając morfologię w epifluorescencji (Rysunek 1C). W przypadku RGC wykazujących ekspresję melanopsyny, stratyfikacja dendrytyczna w wewnętrznej warstwie splotowatej jest wizualizowana poprzez badanie dendrytów wypełnionych znacznikiem fluorescencyjnym w świetle epifluorescencyjnym i określenie, czy rozwarstwiają się one daleko od somy w sublaminie OFF (M1 ipRGC), w pobliżu warstwy komórek zwojowych w sublaminie ON (M2 i M4 ipRGC), czy obu (M3 ipRGC). Ta obserwacja, w połączeniu z rozmiarem somy (M4 mają wyraźnie duże somy w porównaniu ze wszystkimi innymi podtypami ipRGC), pozwala na identyfikację typu komórki. Tak więc technika ta pozwala na identyfikację typu komórki in vitro przed izolacją RNA. Metoda ta może być modyfikowana dla innych protokołów identyfikacji typów komórek obejmujących morfologię dendrytyczną lub fizjologię komórkową.

Wyniki

Rysunek 1: Identyfikacja typó...

Materiały