Obrazowanie fotoaktywacji fluorescencyjnej transportu neurofilamentów w mielinizowanych aksonach myszy

Streszczenie

Źródło: Boyer, N. P. et. al., Obrazowanie i analiza transportu neurofilamentów w wyciętym nerwie piszczelowym myszy. J. Vis. exp. (2020)

Ten film przedstawia metodę fotoaktywacji fluorescencji do analizy transport neurofilamentów w mielinowanych aksonach nerwów obwodowych. Śledząc fotoaktywowane zielone neurofilamenty znakowane fluoroforem, technika ta dostarcza informacji na temat transportu aksonalnego w chorobach neurodegeneracyjnych.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowanie roztworu soli nerwowej

1. Przygotować 100 ml soli fizjologicznej Breuera: 98 mM chlorku sodu (NaCl), 1 mM chlorku potasu (KCl), 2 mM diwodorofosforanu potasu (KH₂PO₄), 1 mM siarczan magnezu (MgSO₄), 1,5 mM chlorek wapnia (CaCl₂), 5,6% D-glukozy, 23,8 mM wodorowęglanu sodu (NaHCO₃) w wodzie podwójnie destylowanej.
2. Wprowadzić 95% tlenu/5% dwutlenku węgla (karbogen) przez roztwór soli przez co najmniej 30 minut przed użyciem. Resztki soli fizjologicznej można ponownie wykorzystać w ciągu tygodnia; Należy go jednak ponownie natlenić przed każdym użyciem.
3. Wlać natlenioną sól fizjologiczną do strzykawki o pojemności 60 ml i upewnić się, że w strzykawce pozostało jak najmniej powietrza.

2. Wstępny montaż komory perfuzji nerwów

1. Podłącz strzykawkę i rurkę, jak pokazano na Rysunek 1A, umieszczając rurkę odpływową w kolbie na odpady.
2. Umieść uszczelkę zewnętrzną w obudowie komory perfuzyjnej, upewniając się, że słupki wlotowe i wylotowe przepływu są wyrównane z otworami w uszczelce.
3. Połóż uszczelkę wewnętrzną (silikon o grubości 100 μm) na okrągłym szkiełku nakrywkowym #1.5 (średnica 40 mm), ostrożnie wygładzając wszelkie zmarszczki w uszczelce, aby zapewnić szczelne uszczelnienie. Aby ułatwić późniejszy montaż, umieść szkiełko nakrywkowe i uszczelkę na ręczniku papierowym lub chusteczce roboczej uszczelką skierowaną do góry.

3. Wypreparowanie i przygotowanie nerwu piszczelowego myszy

1. }Złóż zwierzę w ofierze przez wdychanie dwutlenku węgla lub inną metodę zatwierdzoną przez instytucję. Uruchom odliczanie, gdy zwierzę przestanie się poruszać/oddychać, ponieważ eksperymenty mogą być przeprowadzane tylko w ciągu 3 godzin od złożenia ofiary.
2. Spryskaj sierść 70% etanolem i usuń jak najwięcej z nóg i grzbietu zwierzęcia za pomocą elektrycznej maszynki do golenia.
3. Używając dużych nożyczek do preparacji, wykonaj nacięcie grzbietowe w skórze w pobliżu środka kręgosłupa i kontynuuj cięcie wokół brzusznej części zwierzęcia. Zaczynając od tego cięcia, powoli odbijaj skórę od nóg, delikatnie odciągając ją od mięśnia i przecinając powięź.
4. Umieść zwierzę w pozycji leżącej na tacce sekcyjnej i przypnij wszystkie cztery łapy. Opcjonalnie przypnij ogon, aby jeszcze bardziej ograniczyć ruch.
5. Za pomocą nożyczek do mikrodysekcji wykonaj nacięcie w mięśniach ud w połowie odległości między ogonem a kolanem, aby odsłonić nerw kulszowy. Upewnij się, że nerw, który jest widoczny przez mięsień, nie jest przecięty.
6. Przedłuż nacięcie grzbietowo i brzusznie, aby usunąć mięsień. Podobnie usuń mięśnie łydki, utrzymując płytkie i krótkie cięcia, aby uniknąć uszkodzenia nerwów.
7. Usuń mięśnie, aż nerw piszczelowy zostanie całkowicie odsłonięty od punktu, w którym rozgałęzia się od nerwu kulszowego (w kolanie) do pięty (Rysunek 2A).
   UWAGA: Na wszystkich etapach, w tym i po rozwarstwieniu nerwu piszczelowego, unikaj niepotrzebnej ekspozycji na światło otoczenia, aby zminimalizować możliwą przypadkową aktywację fotoaktywowanego białka zielonej fluorescencji (paGFP) w nerwie.
8. Chwyć nerw piszczelowy na bliższym końcu kręgosłupa za pomocą kleszczy i przetnij nerw za pomocą nożyczek do mikrodysekcji. Uważając, aby nie napinać nerwu, odsuń go od mięśnia, odcinając wszelkie przyczepy.
9. Przeciąć dystalny koniec kręgosłupa nerwu piszczelowego i przenieść na małą szalkę Petriego z solą fizjologiczną o temperaturze pokojowej. Od tego momentu procedury zawsze należy pamiętać o śledzeniu bliższych i dalszych końców nerwu.
   UWAGA: Jednym ze sposobów, aby to zrobić, jest oznaczenie dystalnego końca nerwu cięciem pod kątem, tak aby stożek był widoczny.
10. Zaczynając od bliższego końca nerwu, delikatnie chwyć odsłonięte końce aksonów parą kleszczyków o bardzo cienkich końcówkach.
11. Drugą parą kleszczy chwyć osłonkę nerwową proksymalnie i powoli pociągnij w kierunku dystalnego końca nerwu. Osłonka nerwowa będzie przesuwać się wzdłuż aksonów z minimalnym oporem. Upewnij się, że podczas tego procesu na nerw nie jest nadmiernie napięty.

4. Końcowy montaż komory perfuzyjnej nerwu

1. Chwytając bliższy koniec nerwu, wyjmij go z soli fizjologicznej i powoli połóż na szkiełku nakrywkowym komory perfuzyjnej w prostokątnym otworze wewnętrznej uszczelki, utrzymując delikatne napięcie nerwu podczas kładzenia go tak, aby leżał prosto.
2. Umieść zjeżdżalnię mikroakweduktu nad nerwem tak, aby rowkowana strona była skierowana w stronę nerwu i kierunek przepływu był równoległy do nerwu. Odwróć szkiełko nakrywkowe i zespół mikroakweduktu i umieść go w obudowie komory perfuzyjnej ze zjeżdżalnią mikroakweduktu przymocowaną do zewnętrznej uszczelki. Nerw i otaczająca go uszczelka wewnętrzna zostaną teraz umieszczone między szkiełkiem nakrywkowym a zjeżdżalnią mikroakweduktu, które są oddzielone uszczelką, z szkiełkiem nakrywkowym skierowanym do góry (Rysunek 1B).
3. Zabezpiecz komorę perfuzyjną, umieszczając ją w metalowej obudowie i obracając pierścień blokujący. Upewnij się, że plastikowa obudowa znajduje się całkowicie pod wszystkimi metalowymi klipsami i dobrze dokręć, aby zapobiec wyciekowi soli fizjologicznej. Zbyt mocne dokręcenie może spowodować pęknięcie zjeżdżalni mikroakweduktu lub szkiełka nakrywkowego. Odwróć komorę tak, aby szkiełko nakrywkowe było skierowane w dół.
4. Powoli wciskać tłok strzykawki z solą fizjologiczną, aby napełnić komorę perfuzyjną. Rurki wlotowe i wylotowe, kolba wylotowa i strzykawka powinny być uniesione nad samą komorą przez cały czas podczas ustawiania i obrazowania. Pozwala to uniknąć syfonowania, które może wprowadzać pęcherzyki lub powodować niestabilność ostrości z powodu podciśnienia w komorze.
5. Przenieś zestaw perfuzyjny do odwróconego stolika mikroskopowego i zamontuj strzykawkę z solą fizjologiczną w pompie strzykawkowej. Uruchom silnik z odpowiednią prędkością dla natężenia przepływu 0,25 ml/min. Następnie podłącz i włącz wbudowany podgrzewacz roztworu ustawiony na 37 °C.
6. Podłącz grzejnik obiektywowy i ustaw na 37 °C, nałóż olej na obiektyw i włóż komorę perfuzyjną do mocowania stage.
7. Nałóż olej na podkładkę grzejną komory i przymocuj do komory perfuzyjnej. Podłącz i włącz grzałkę komory; ustawić na 37 °C.
   UWAGA: Zmiany temperatury mogą powodować tworzenie się pęcherzyków w komorze perfuzyjnej z powodu odgazowania roztworu. Jeśli tworzą się pęcherzyki, na krótko zwiększ natężenie przepływu roztworu o 5-10x, aż pęcherzyki opróżnią komorę.
8. Zablokuj komorę perfuzyjną w stage adapter i doprowadź olej do obiektywu w kontakt ze szkiełkiem nakrywkowym na spodzie komory.
   UWAGA: Zastosowane tutaj komory Bioptechs z adapterem stopnia ASI są przeznaczone do konfiguracji mikroskopu odwróconego.

5. Aktywacja fluorescencji i akwizycja obrazu

1. Korzystając z oświetlenia jasnego pola, skup się na warstwie aksonów na dolnej powierzchni nerwu najbliżej powierzchni szkiełka nakrywkowego (Rysunek 2B). Mielinizowane aksony (zwykle o średnicy 1-6 μm u dorosłych myszy) można zidentyfikować po obecności osłonki mielinowej, która jest widoczna w świetle przechodzącym w jasnym polu bez wzmocnienia kontrastu. Szczeliny i węzły Schmidta-Lantermana są również łatwo widoczne. Aksony niezmielinizowane są smuklejsze (zwykle o średnicy <1 μm) i są na ogół obecne w wiązkach (wiązkach Remak), gdzie są na ogół zbyt blisko siebie, aby można je było od siebie rozdzielić.
2. Jeśli jest to dostępne w mikroskopie, aktywuj system automatycznego ustawiania ostrości, aby utrzymać ostrość w trakcie obrazowania poklatkowego.
3. Uzyskaj obraz referencyjny w jasnym polu. Zapisz orientację nerwu (kolczaste końce bliższe i dystalne) w odniesieniu do obrazów.
4. Uzyskaj obraz konfokalny za pomocą lasera 488 nm i filtra emisyjnego odpowiedniego dla paGFP (np. 525/50 nm) w celu zarejestrowania autofluorescencji przed wybielaniem. Utrzymuj moc lasera na niskim poziomie, aby zminimalizować fotowybielanie, z odpowiednio dostosowanym czasem ekspozycji, aby wykryć słaby sygnał. Na przykład reprezentatywne dane uzyskano przy 5% mocy lasera i 4 s ekspozycji. Zapisz ustawienia pozyskiwania, które będą używane we wszystkich przyszłych eksperymentach.
   UWAGA: Po fotoaktywacji, idealne ustawienia obrazowania stworzą stosunek sygnału do szumu > 8 i fotowybielanie mniejsze niż 25% oryginalnego sygnału w ciągu 20 obrazów. Aksony można również obrazować za pomocą szerokokątnej mikroskopii epifluorescencyjnej, tak jak to zrobiliśmy pierwotnie, ale jakość obrazu będzie gorsza ze względu na brak konfokalności.
5. Ustaw moc lasera na około 5x normalną moc obrazowania i uzyskaj obraz z czasem naświetlania 3-4 minut. Chociaż nie jest to konieczne, ten krok jest zalecany do wybielania autofluorescencji i innych źródeł niepożądanej fluorescencji w celu zmniejszenia sygnału tła, a tym samym maksymalizacji sygnału do szumu fluorescencji aktywowanej fotoaktywem.
6. Uzyskaj obraz z ustawieniami użytymi w kroku 5.4, aby zarejestrować autofluorescencję przed aktywacją po tym etapie wybielania.
7. Na obrazie w jasnym polu narysuj linię równoległą do aksonów o długości równej żądanemu rozmiarowi okna aktywacji. Długość tego okna będzie się różnić w zależności od celu i parametrów eksperymentalnych, ale typowe długości to 5 μm dla paradygmatu ucieczki impulsu i 40 μm dla paradygmatu rozproszenia impulsu.
8. Używając tej linii jako przewodnika, narysuj prostokątny obszar zainteresowania (ROI) w poprzek pola widzenia prostopadłego do aksonów. Obszar ten musi obejmować wszystkie aksony, które mają być fotoaktywowane.
9. Określ optymalne ustawienia fotoaktywacji z oświetleniem 405 nm.
   UWAGA: Wykonuj ten krok i podkroki tylko przed pierwszą eksperymentalną aktywacją. W trakcie eksperymentu należy użyć tych samych ustawień fotoaktywacji.
   1. Aktywuj obszar zainteresowania wielokrotnie za pomocą linii laserowej 405 nm, niskiej mocy lasera (np. 5%) i czasu przebywania piksela (np. 40 μs) oraz jednego impulsu, uzyskując obraz aktywowanego białka zielonej fluorescencji lub fluorescencji GFP po każdej aktywacji. Powtarzaj, aż fluorescencja przestanie się zwiększać, a następnie określ ilościowo fluorescencję w obszarze zainteresowania dla każdego obrazu.
   2. Wykreśl średnią intensywność fluorescencji w funkcji liczby impulsów. Wybierz liczbę impulsów, po których fluorescencja nie wzrasta, jako optymalną liczbę impulsów do aktywacji.
10. Aktywuj fluorescencję paGFP w obszarze narysowanym w kroku 5.8 przez wzbudzenie wzorzyste światłem o długości fali 405 nm. Upewnij się, że obraz został uzyskany tuż przed aktywacją i tuż po niej.
    UWAGA: Idealna aktywacja paGFP wytworzy jasno zdefiniowany obszar fluorescencji z ostrymi granicami zawartymi w obszarze zainteresowania lub ROI.
11. Uruchom 1-minutowy minutnik po zakończeniu aktywacji. Pod koniec 1 minuty rozpocznij pobieranie serii poklatkowej.
    UWAGA: 1-minutowe opóźnienie jest konieczne, aby umożliwić wzrost fluorescencji, który obserwuje się po fotoaktywacji paGFP. W przypadku metody rozrzutu impulsów 5-10-minutowy okres akwizycji z 30-sekundowymi interwałami poklatkowymi jest wystarczający do pomiaru początkowych nachyleń w środkowym i bocznym oknie w celu zmierzenia prędkości i kierunkowości. W przypadku metody ucieczki impulsów okres akwizycji wynoszący 30-150 minut z 5 lub 10-minutowymi interwałami poklatkowymi pozwala na analizę długoterminowego zachowania włókien podczas pauzy.
12. Zapisz wszystkie uzyskane obrazy, a także zwrot z inwestycji używany do aktywacji fluorescencji.
13. Przejdź do nowego obszaru nerwu i powtórz kroki 5.1-5.11. Jeśli nowy region znajduje się wzdłuż tego samego aksonu, musi znajdować się co najmniej 500 μm od poprzednio aktywowanego obszaru, aby uniknąć wykrycia fluorescencyjnych neurofilamentów, które przemieściły się z drugiego aktywowanego obszaru. Zdobycie ostatniego timelapse musi zakończyć się przed końcem 3-godzinnego okna.
    UWAGA: Możliwe, że preparat może być skuteczny dłużej niż 3 godziny, ale tego nie potwierdziliśmy. Dzięki umiejętnej analizie i przygotowaniu w ciągu tego 3-godzinnego okna można uzyskać od pięciu do ośmiu 10-minutowych zestawów zdjęć poklatkowych.
14. Po uzyskaniu końcowej serii zdjęć poklatkowych należy zatrzymać przepływ soli fizjologicznej, odłączyć roztwór i grzałki komory oraz wyjąć aparat perfuzyjny ze stolika mikroskopowego.

Wyniki

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
14 x 22 Uszczelka prostokątna 0,1 mm	Bioptechs	1907-1422-100	Uszczelka wewnętrzna
2-deoksy-D-glukoze	Sigma	D6134
30mm Okrągła uszczelka z otworami	Bioptechs	1907-08-750	Uszczelka zewnętrzna
35 x 10mm talerz	Thermo Fisher	153066	Naczynia rozwarstwiające
40mm okrągłe szkiełka nakrywkowe	Bioptechs	40-1313-0319
strzykawka 60 ml - końcówka Luer-lock	BD	309653
System konfokalny Andor Revolution WD z wirującym dyskiem	Andor		Wyposażony w systemy Perfect Focus i FRAPPA
Chlorek wapnia	Fisher	C79
Coverslips	Fisher	12-541-B	Dla slajdu fluoresceinowego
D-(+)-roztwór glukozy	Sigma	G8769
Szpilki do preparowania	Narzędzia do nauki o szczegółach	26001-70
Kleszcze preparacyjne	Narzędzia do nauki o szczegółach	11251-30	Kleszczyki z cienką końcówką
Mikroskop separacyjny	Zeiss	47 50 03
Patelnia sekcyjna z woskiem	Ginsberg Scientific	568859
Nożyczki do preparacji	Narzędzia do nauki o szczegółach	14061-09	Nożyczki do wstępnego rozwarstwienia
Komora perfuzyjna FCS2	Bioptechs	60319-02-03
Fluoresceina sodowa	Fluka	46960
Wbudowany podgrzewacz roztworu	Warner Instruments	SH27-B
kleszcze do laminektomii	Narzędzia do nauki o szczegółach	11223-20	Początkowe kleszcze preparacyjne
Siarczan magnezu	Sigma-Aldrich	M7506
Zjeżdżalnia mikroakweduktu	Bioptechs	130119-5
Szkiełka mikroskopowe	Fisher	12-544-3	Dla slajdu fluoresceinowego
Wkładka do stolika mikroskopu	Applied Scientific Instrumentation	I-3017
System ogrzewania obiektywu	Okolab		Oko Touch z obiektywem obroża
Olej obiektywny - typ A	Nikon
Plan Apo VC 100x 1.40 NA obiektyw	Nikon	MRD01901
Chlorek potasu	Fisher	P217
Fosforan potasu	Sigma-Aldrich	P0662
Wodorowęglan sodu	Sigma-Aldrich	S6297
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Pompa strzykawkowa	Instrumenty Sage	Model 355
Adapter rurkowy - żeński	Small Parts Inc.	1005109
Adapter rurkowy - męski	Small Parts Inc.	1005012
Rurka Tygon	Bioptechs		1/16" ID, 1/32" grubość ścianki
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15018-10	cienkie nożyczki

wycofane