Mikroskopia dwufotonowa do obrazowania morfologii neuronów u szczeniaka myszy

Streszczenie

Source: Mizuno, H., et al. In Vivo Dwufotonowe obrazowanie neuronów korowych u noworodków myszy. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film prezentuje mikroskopię dwufotonową używaną do obrazowania neuronów w mózgu znieczulonego transgenicznego szczeniaka myszy. Laser dwufotonowy pozwala na głębsze obrazowanie z wysoką rozdzielczością przestrzenną i minimalnym rozpraszaniem światła, umożliwiając szczegółowe uchwycenie morfologii neuronów, w tym projekcji dendrytycznych.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały poddane przeglądowi przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną JoVE Komisja recenzencka.

1. Przygotowanie okna czaszkowego

1. Znieczulenie szczeniaka za pomocą izofluranu (1,0% - 2,0%) i sprawdzenie poziomu znieczulenia za pomocą testu szczypania ogona.
2. Figure 1C₂, i 2 mmol/L MgSO₄; pH 7,4; 300 mOsm/L; temperatura pokojowa), aby zatrzymać krwawienie. Otwierając czaszkę, nałóż bufor kory mózgowej, aby powierzchnia mózgu była wilgotna.
3. UWAGA: Rysunek 1D i1E).
4. Figure 1F).
5. Rysunek 1GFigure 1H).
6. 2. Obrazowanie dwufotonowe
   1. UWAGA:<span style='rodzina czcionek:Roboto,bezszeryfowy;rozmiar czcionki:12pt;styl czcionki:normalny;wariant czcionki:normalny;grubość czcionki:400;dekoracja tekstu:brak;wyrównanie w pionie:linia bazowa;biała przestrzeń:wstępne zawijanie;'> Moc lasera powinny być zmniejszane w miarę przesuwania się pozycji Z w górę.
   2. Rysunek 2A i 2B). Wyreguluj głowicę tak, aby szkiełko nakrywkowe było równoległe do soczewki obiektywu za pomocą stolika goniometru (Rysunek 2BUWAGARysunek 2B i 2C).
   3. Figure 2D2EUWAGA:

Wyniki

Rycina 1: Operacja, przygotowanie okna czaszkowego i mocowanie pręta tytanowego. (A) Ten panel pokazuje usu...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
pK031. TRE-Cre	Autorzy	-	Dostępne od RIKEN BRC i Addgene
pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE	Autorzy	-	Dostępne od RIKEN BRC i Addgene
pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE	Autorzy	-	Dostępne od autorzy
Isoflurane	Wako	099-06571
410 Jednostka anestezjologiczna (maszyna do gazu izofluranowego)	Univentor	8323101
Vetbond (klej do tkanek)	3M	084-1469SB
MμltiFlex Round (końcówka ładowania)	Sorenson	13810
Gelfoam (gąbka żelatynowa)	Pfizer	09-0353-01
Agarose	Sigma	A9793	Niska temperatura topnienia
Okrągłe szkiełko nakrywkowe	Matsunami	-	Custom made
Unifast 2 (cement dentystyczny)	GC	-
Pasek tytanu	Autorzy	-	Wykonane na zamówienie (patrz rysunek 1G)
Rimadyl (carprofen)	Zoetis	-	Injectable
mikroskop 2-fotonowy	Zeiss	LSM7MP
Laser tytanowo-szafirowy	Spertra-Physics	Mai-Tai eHPDS
Płyta tytanowa	Autorzy	-	Wykonane na zamówienie (patrz rysunek 2A)
IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro	BITPLANE
Etap goniometru	Thorlabs	GN2/M