Obrazowanie bioluminescencyjne do badania stanów przejściowych wapnia w strukturach mózgu Drosophila

Streszczenie

Źródło: Lark, A. R., et. al., Podejście do funkcjonalnego obrazowania mózgu in vivo oparte na bioluminescencyjnym wskaźniku wapnia GFP-aequorin. J. Vis. exp. (2016)

Ten film przedstawia obrazowanie dynamiki wapnia w czasie rzeczywistym za pomocą Greena bioluminescencja białka fluorescencyjnego i aequoryny w głębokich strukturach mózgu .

Protokół

1. Obrazowanie

1. Setup
   1. Uruchom system nagrywania, włączając mikroskop, komputer, kamerę i system drenażowy oraz ustawiając kontrolę środowiska w pomieszczeniu na 25 °C.
   2. Otwórz pomiar i Program Eksplorator automatyzacji na komputerze. Kliknij "Urządzenia i interfejsy", następnie kliknij dwukrotnie "NI Motion Devices", a na koniec kliknij prawym przyciskiem myszy "PCI-7334" i wybierz "zainicjuj urządzenie".
   3. Otwórz program Photon Imager. Utwórz nowy folder i nazwij pierwszy plik nagrania. Kamera musi osiągnąć temperaturę -80 °C, zanim system będzie działał.
   4. Ustaw system perfuzyjny: Dodaj KCl (chlorek potasu), nikotynę i roztwór Ringera do zbiorników i dostosuj tak, aby każdy roztwór rozpływał się z prędkością 2 ml/min. Przemyć roztworem Ringera przed rozpoczęciem eksperymentu.
2. Przygotuj próbkę
   1. Umieść miskę blokową do obrazowania na montażu pod mikroskopem pod mikroskopem przy 5-krotnym powiększeniu i włóż rurkę perfuzyjną do kanału przez nakłucie.
   2. Ustaw mikroskop w trybie fluorescencyjnym, a następnie wyśrodkuj i ustaw ostrość na ciałach grzybów (MB). Dostosuj do 20X, ponownie wyśrodkuj i ustaw ostrość.
   3. Umieść urządzenie drenażowe nad basenem drenażowym, wyreguluj wysokość bocznika drenażowego tak, aby końcówka znajdowała się tuż nad basenem i uruchom roztwór Ringera na 30 sekund, aby zapewnić odpowiedni drenaż.
   4. Pociągnij osłonę w dół, aby odgrodzić urządzenie od światła. Korzystając z automatycznego systemu w imagerze fotonów, dokonaj precyzyjnych regulacji ostrości i zrób referencyjny obraz fluorescencyjny MBs.
3. Nagrywanie
   1. Ustaw prędkość fotonów do żądanej prędkości nagrywania (od 50 ms do 1 sekundy lub więcej). Wybierz tryb fotonowy i otwórz migawkę. Zapisuj genotyp, płeć, wiek i numer próbki we wpisach dziennika. Dostosuj położenie pól ROI (Region of interest) nad kielichem i ciałami komórek (CCB) oraz płatami przyśrodkowymi, klikając pola ROI i przeciągając, przytrzymując kontrolę.
   2. Nagrywaj linię bazową przez około 5 do 10 minut (zgodnie z potrzebami).
   3. Stosuj nikotynę przez 1 minutę. Zanotuj start/stop w dzienniku. Myć roztworem Ringera przez 5 minut.
   4. Odczekaj 5 minut do odzyskania i przygotuj wpis do dziennika KCl (chlorek potasu) oraz minutnik.
   5. Stosować KCl przez 1 min. Zanotuj start/stop w dzienniku. Myj roztworem Ringera przez 1 minutę.
   6. Przełącz na tryb fluorescencyjny, zrób ostatnie zdjęcie fluorescencyjne i wyłącz roztwór Ringera.
   7. Naciśnij "Stop". Pojawi się okno dialogowe z pytaniem, czy chcesz wyłączyć system. Wybierz "Nie", aby kontynuować nagrywanie.
   8. Otwórz osłonę, przesuń system drenażowy, przełącz obiektyw obiektywu na 5X i wyjmij rurkę perfuzyjną. Wyjmij próbkę/naczynie nagrywające ze stolika i wyczyść obiektyw 20X, spłukując i dwukrotnie wycierając obiektyw wodą.
   9. Naciśnij biały przycisk odtwarzania w górnej części okna programu, aby rozpocząć następne nagrywanie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014
Chlorek wapnia	Merck	1023911000
HEPES	Sigma-Aldrich	7365-45-9
Chlorek potasu	Prolabo	26 764.298
Chlorek magnezu	Prolabo	25 108.295
Sacharoza	Sigma-Aldrich	S0389
Nicotine	Sigma-Aldrich	N3876
ATP	Sigma-Aldrich	A2383	Hydrat soli disodowej adenozyno-5′-trifosforanu
Benzyl-coelenterazine	Prolume, nanolight<	http://www.prolume.com/<
Końcówki do pipet	Corning Incorporated	4868	100-1000μL uniwersalna końcówka do pipety
EM-CCD camera	Andor	DU-897E-CS0-#BV	iXon (schłodzony do -80°C)
Mikroskop	Nikon	N/A	Eclipse-E800
Soczewka obiektywu immersyjnego	Nikon	N/A	20x Fluor .5w
Mikroskop preparacyjny z fluorescencją	Leica MZ Fl III	N/A	luneta leica i lampa fluorescencyjna
Pompa perystaltyczna	Gilson	N/A	style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:word-wrap:4;'>Minipuls 2
Tubing	Fisher Scientific	Zależy od grubości	Tygon R3603, St-Gobain
System perfuzji	Warner	64-0135 (VC-66CS)	System sterowania zaworem perfuzyjnym, kompletny, z zaworami zaciskowymi, 6-kanałowy
Regulatory perfuzji	Leventon	201108	przepływ dosi-3
Eksplorator pomiarów i automatyzacji	Nauki Towary i instrumenty krajowe	n/A	software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
Photon imager	Science Wares & National Instruments	N/A	software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
Photon viewer	Science Wares & National Instituments	n/A	software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
Excel	Microsoft	N/A	software https://www.microsoft.com
Wirtualny dub	open access	N/A	oprogramowanie http://virtualdub.sourceforge.net/

td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:word-wrap;strategia:4;'>Kot #301 Coelenterazine htr style='height:20px;'>