Celowana ablacja neuronów przy użyciu mikroskopii dwufotonowej u danio pręgowanego Larava

Abstract

Źródło: Muto, A., et al. Ablacja populacji neuronów za pomocą lasera dwufotonowego i jej ocena za pomocą obrazowania wapnia i rejestracji behawioralnej larw danio pręgowanego. J. vis. exp. (2018)

W tym filmie Zademonstrowano procedurę dwufotonowej ablacji laserowej, umożliwiającą selektywne niszczenie neuronów fluorescencyjnych w unieruchomionych agarozą larwach danio pręgowanego. Obrazowanie w wysokiej rozdzielczości przed i po zabiegu potwierdza skuteczne uszkodzenie neuronów, co obserwuje się przy braku fluorescencji.

Protocol

1. Ablacja subpopulacji neuronów za pomocą dwufotonowego mikroskopu laserowego

1. Zacznij od ustawienia połączenia linii Gal4, która oznacza konkretne neurony do badania oraz UAS:EGFP lub UAShspzGCaMP6s. Upewnij się, że używasz tła nacre tło dla obojga rodziców, aby nacre homozygot można uzyskać.
   UWAGA: Homozygoty <span style='font-family:Roboto;font-size:12.0pt;' lang='EN-US'>nacre nie zawierają melanoforów na powierzchni ciała (Rysunek 1B). W niniejszym badaniu zastosowano linię Gal4 gSAIzGFFM119B (która oznacza przedpiersie) i inną linię Gal4 hspGFFDMC76A (która oznacza ILH (płat podwzgórza).

2. Następnego dnia konfiguracji godowej zbierz jaja danio pręgowanego i podnieś je do stadium larwalnego, w którym to momencie neurony będące przedmiotem zainteresowania wyrażą fluorescencyjne reportery.

3. Zamontuj larwę danio pręgowanego w agarozie o niskiej temperaturze topnienia 2% (Rysunek 1B).

1. Zacznij od przygotowania 2% roztworu wyjściowego agarozy: rozpuść 2 g proszku agarozy o niskiej temperaturze topnienia w 100 ml wody systemowej (i.e., woda używana do utrzymywania dorosłego danio pręgowanego w systemie wody krążącej) lub wodę E3, poprzez doprowadzenie wody do temperatury wrzenia w kuchence mikrofalowej i energiczne mieszanie.

   1. Podgrzewaj w kuchence mikrofalowej 2% bulion agarozowy o niskiej temperaturze topnienia, aż się zagotuje. Wlej 3,5-4,0 ml agarozy na pokrywkę 6-centymetrowej szalki Petriego. Poczekaj, aż agaroza ostygnie, aby była ciepła w dotyku, zanim przejdziesz dalej.

   2. Następnie umieść pojedynczą larwę (nie znieczuloną na tym etapie) w agarozie. Kontynuuj regulację pozycji i orientacji larwy tak, aby była w pozycji pionowej, za pomocą igły preparującej (ryc. 1C), aż agaroza zestali się, aby zapewnić prawidłowe ułożenie larwy.
      UWAGA: Larwa będzie nadal pływać, podczas gdy agaroza zastyga.

   3. Gdy larwa zostanie umieszczona, odczekaj 5 minut, aż agaroza całkowicie się zestali

   .

   4. Na agarozę wlać 5 ml roztworu tricainy (0,4% przy 1x stężeniu roboczym).
      UWAGA: Aby uniknąć ruchów larw podczas ablacji laserowej, larwy muszą być znieczulone przez cały czas trwania procedury ablacji.

4. Ablate larwy za pomocą funkcji wybielania w dwufotonowym systemie mikroskopii laserowej.

1. Umieść larwę osadzoną w agarozie pod dwufotonowym laserowym mikroskopem skaningowym i uruchom system mikroskopowy.

2. Uruchom oprogramowanie do akwizycji obrazu i kliknij przycisk "Włącz" na karcie "Laser", aby włączyć laser (Rysunek 1D). Poczekaj, aż "Stan" lasera zmieni się z "Zajęty" na "Zablokowany w trybie".

3. W zakładce "Kanały" ustaw długość fali lasera na 880 nm (maksymalna moc: około 2,300 mW) dla ablacji EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) lub na 800 nm (maksymalna moc: około 2,600 mW) dla ablacji GCaMP.

4. Wybierz obiektyw 20X, ręcznie przesuwając rewolwer obiektywu. Kliknij kartę "Zlokalizuj", kliknij "GFP" (zielone białko fluorescencyjne), aby zmienić ścieżki optyczne i bezpośrednio view fluorescencja na oko.

5. Zlokalizuj mózg larwy danio pręgowanego w centrum widoku; następnie kliknij zakładkę "Akwizycja", aby wrócić do mikroskopii dwufotonowej.

6. Jako zapis stanu 'przed ablacją', zrób zdjęcie z-stack za pomocą soczewki obiektywu 20X z dużą prędkością skanowania (aby uniknąć uszkodzenia termicznego). Później porównaj obrazy wykonane przed i po eksperymentach ablacyjnych (ryc. 2A). Aby uzyskać z-stack, kliknij "Z-Stack", aby wybrać opcję z-stack i rozwinąć zakładkę. Ustaw dolną granicę (kliknij przycisk "Ustaw najpierw") po skupieniu się na brzusznym końcu mózgu larwy i ustaw górną granicę (kliknij przycisk "Ustaw ostatnią") po skupieniu się na najbardziej grzbietowej powierzchni mózgu. Następnie kliknij przycisk "Rozpocznij eksperyment", aby uruchomić akwizycję obrazu z-stack.

7. Wybierz obiektyw 63X, ręcznie przesuwając rewolwer obiektywu.

8. Kliknij zakładkę "Zlokalizuj", aby przełączyć się na mikroskopię epifluorescencyjną, zlokalizuj komórki, które mają być ablowane w centrum widzenia przez oko, a następnie kliknij zakładkę "Akwizycja", aby wrócić do laserowej mikroskopii skaningowej.

5. W zakładce "Tryb akwizycji" ustaw "Rozmiar ramki" na 256 x 256. Kliknij "Na żywo" i obserwuj interesujące Cię neurony.

6. Zaczynając od najbardziej grzbietowej strony, znajdź płaszczyznę ogniskową, w której komórki, które mają zostać poddane ablacji, są ostre.

7. Zaznacz mały, okrągły obszar o średnicy około jednej trzeciej średnicy komórki na każdym neuronie jako obszar zainteresowania (ROI) za pomocą funkcji "Regions".

8. < span style='kolor:#1A202C;'>Ustaw prędkość skanowania na 13.93 s/256 x 256 pikseli (134.42 μm x 134.42 μm), co odpowiada czasowi przebywania lasera około 200 μs/piksel lub 200 μs/0.5 μm. Ustaw również 4 powtórzenia ("Cykl iteracji: 4"). Alternatywnie zoptymalizuj liczbę iteracji i szybkość skanowania, aby osiągnąć wystarczającą ablację.

9. < span style='kolor:#1A202C;'>Wykonaj funkcję 'Wybielanie' dla ablacji, w połączeniu z 'Szeregiem czasowym (2 cykle)', aby zobrazować próbkę (przed i po ablacji) i 'Regiony' (aby ustawić ROI) lub równoważne funkcje w używanym oprogramowaniu (Rysunek 1D).

10. Porównując pierwszy obraz (przed ablacją) i drugi obraz (po ablacji) w cyklu szeregów czasowych, upewnij się, że po wybielaniu fluorescencja w docelowych komórkach zmniejsza się do wartości obserwowanej na poziomie tła (Rysunek 2B).

11. < span style='kolor:#1A202C;'>Jeśli po ablacji fluorescencja jest nadal obecna, zwiększ liczbę iteracji.

12. < span style='kolor:#1A202C;'>Następnie przesuń płaszczyznę ogniskowej nieco głębiej (i.e., w stronę brzusznej) i wybierz następną płaszczyznę ogniskową, w której pojawiają się nieablowane komórki.

13. < span style='kolor:#1A202C;'>Wykonaj funkcję wybielania. Powtarzaj te kroki, aż wszystkie komórki w interesującej nas strukturze neuronalnej zostaną usunięte.

14. < span style='kolor:#1A202C;'>Po przejściu przez wszystkie płaszczyzny ogniskowe pokrywające struktury nerwowe, które mają zostać poddane ablacji, sprawdź komórki pod kątem zniesionej fluorescencji. Jeśli okaże się, że niektóre komórki nadal są fluorescencyjne z powodu niewystarczającej ablacji, należy je ponownie naświetlić laserowo, jak opisano powyżej.

15. Jeśli larwa musi zostać odzyskana z agarozy po napromieniowaniu laserowym, nie próbuj wypychać jej z agarozy, ponieważ może to uszkodzić larwę. Zamiast tego ostrożnie wykonaj drobne nacięcia w agarozie wokół larwy prostopadle do powierzchni jej ciała. Następnie poczekaj, aż larwa sama wypłynie z agarozy, gdy środek znieczulający ustąpi.

16. Przejdź do następnej larwy w celu ablacji lub przeprowadź eksperymenty kontrolne przy użyciu innej populacji neuronów, które nie są zaangażowane w badane zachowanie.
    UWAGA: Tutaj, jako kontrola, neurony opuszki węchowej w UAS:EGFP; larwy gSAIzGFFM119B zostały poddane laserowej ablacji przy użyciu tego samego protokołu opisanego powyżej (Rysunek 2A, po prawej).

17. Odczekaj kilka godzin lub 1 dzień na odzyskanie przed przystąpieniem do obrazowania Ca lub rejestracji behawioralnej. Podczas tego czasu rekonwalescencji sprawdź stan zdrowia larw (i.e., normalne spontaniczne pływanie, brak widocznych uszkodzeń termicznych wokół obszaru ablacji, etc.) i usuń larwy wykazujące jakiekolwiek oznaki złego stanu zdrowia.

Results

Materials