$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały poddane przeglądowi przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Wstrzyknięcie barwnika fluorescencyjnego
- Uszczypnij skórę znieczulonej myszy w przyśrodkowe lewe udo za pomocą kleszczy #5. Delikatnie pociągnij skórę do góry i użyj nożyczek, aby przeciąć i usunąć skórę. Przygotować sprzężony z dekstranem barwnik rodaminowy o barwie czerwonej (70 kDa) (10 mg/kg rozpuszczony w roztworze soli fizjologicznej).
- Zlokalizuj żyłę udową. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z dołączoną igłą 30 G pobrać uprzednio przygotowany roztwór barwnika fluorescencyjnego odpowiedniego do obrazowania do linii 130 μl strzykawki. Usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza, całkowicie wciągając barwnik do strzykawki i mocno przesuwając ściankę strzykawki.
- Zegnij igłę 30 G pod kątem około 30 stopni, dociskając ją do twardej powierzchni ukośnie do góry. Napełnij igłę barwnikiem i wyrzuć nadmiar płynu, pozostawiając próbkę o objętości 100 μl.
- Powoli wstrzyknąć 100 μl próbki barwnika do żyły udowej. Po wyjęciu igły należy równomiernie, delikatnie uciskać miejsce wstrzyknięcia, aby zatamować krwawienie. Pozwól barwnikowi krążyć przez 5 minut.
- Zamknij lewe udo, zszywając skórę szwem 4-0, a następnie ostrożnie przełóż mysz na brzuch i umieść ją w uprzęży nagłówka myszy.
2. In Vivo Obrazowanie dwufotonowe
- Przenieś aparat chirurgiczny do mikroskopu dwufotonowego, upewniając się, że utrzymujesz ciągły poziom znieczulenia. Umieść niewielką ilość 0,9% soli fizjologicznej w zbiorniku na płycie głównej i opuść obiektyw mikroskopu tak, aby zetknął się z solą fizjologiczną. Zlokalizuj obszar zainteresowania za pomocą obiektywu do oglądania w jasnym polu.
- Ustaw wzbudzenie lasera dwufotonowego na długość fali odpowiednią dla barwnika fluorescencyjnego. Rozpocznij obrazowanie dwufotonowe za pomocą obiektywu 25x.
Zauważ, że w tych eksperymentach użyliśmy dekstranu sprzężonego z emitującym czerwień barwnikiem rodaminy, który był wzbudzany przy długości fali 780 nm. Do wykrywania fluorescencji barwnika użyto filtra pasmowoprzepustowego 607/36, a do wykrycia autofluorescencji tętniczej zastosowano filtr emisyjny pasmowoprzepustowy 480/20. - Zlokalizuj złoże kapilarne na ekranie widoku i powiększ ten obszar za pomocą zoomu optycznego 2. Uzyskaj obrazy naczyń włosowatych za pomocą oprogramowania do obrazowania dwufotonowego.