Obrazowanie czasu życia fluorescencji agregacji białka PolyQ w neuronach Caenorhabditis elegans

Streszczenie

Źródło: Pigazzini, M. L., et. al. Charakterystyka struktur amyloidowych w starzeniu się C. Elegans Korzystanie z obrazowania czasu życia fluorescencji. J. Vis. exp. (2020).

Ten film demonstruje zastosowanie mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM) do oceny agregacji białek polyQ w neuronach C. elegans, porównując robaki kontrolne i robaki z niedoborem białka opiekuńczego. Zwiększona agregacja u robaków z niedoborem białka opiekuńczego sprzyja przenoszeniu energii między skupionymi fluoroforami, skracając czas życia fluorescencji. Mapy oznaczone kolorami generowane przez FLIM przedstawiają te różnice, podkreślając poziomy agregacji między grupami eksperymentalnymi.

Protokół

1. Akwizycja danych FLIM

UWAGA: W tym protokole czas życia fluoroforu jest uzyskiwany za pomocą metody TCSPC w dziedzinie czasu. FLIM wymaga, aby impuls światła był generowany przez laser z ustaloną i stałą częstotliwością powtarzania. Częstotliwość powtarzania różni się w zależności od typu lasera i musi być znana użytkownikowi. Pomiary żywotności są osiągane za pomocą detektorów i sprzętu elektronicznego zainstalowanego wraz z konwencjonalnym mikroskopem. W tym protokole pomiary są wykonywane na trzech różnych laserowych skaningowych mikroskopach konfokalnych z detektorami i oprogramowaniem dostarczonym przez dwie różne firmy (Tabela materiałów) w celu uzyskania odpowiednio czasów życia mRFP, CFP i YFP. Przed rozpoczęciem sprawdź, czy zainstalowane są odpowiednie filtry emisji/wzbudzenia i zminimalizuj podświetlenie tła lub monitora. Przed rozpoczęciem jakiegokolwiek eksperymentu należy ustalić fotostabilność wybranego fluoroforu. Jeśli fluorofor wybiela się w krótkim czasie w tkankach nicienia, nie nadaje się do pomiarów FLIM w C. elegans.

1. Otwórz oprogramowanie do akwizycji FLIM. Oprogramowanie FLIM umożliwia również sterowanie mikroskopem konfokalnym. Znajdź zakładkę/przycisk, aby umożliwić włączenie wyjść czujnika i naciśnij Włącz wyjścia.
2. Uzyskaj funkcję odpowiedzi instrumentu (IRF), która opisuje precyzję czasu konfiguracji instrumentalnej.
   UWAGA: Ten krok powinien być wykonany najlepiej przed zamontowaniem nicieni.
   1. Jeśli to możliwe, wyjmij filtry wzbudzenia/emisji.
   2. Umieść puste szkiełko nakrywkowe nad obiektywem i znajdź jego powierzchnię. Rejestruj sygnał rozproszenia uzyskany z szkiełka nakrywkowego przez co najmniej 30 s.
      UWAGA: Dla czasów życia wynoszących kilka nanosekund oprogramowanie do akwizycji może automatycznie oszacować przesunięcie IRF. Uzyskanie IRF jest zawsze zalecane.
3. Umieść zjeżdżalnię z zamontowanym C. elegans na scenie. Za pomocą soczewki z 10-krotnym powiększeniem w trybie transmisji i zlokalizuj położenie nicieni na szkiełku.
4. Zdejmij szkiełko, zmień obiektyw na soczewkę o powiększeniu 63x i nałóż wymagane medium immersyjne (np. olej). Załóż szkiełko na stoliku i zlokalizuj nicienie.
5. Znajdź Pinhole Manager w oprogramowaniu do akwizycji i otwórz go w Maximum. Rozpocznij skanowanie próbki, wybierz obszar zainteresowania (np. głowa, górna część ciała) i skup się na jego maksymalnej płaszczyźnie projekcji.
6. Monitoruj częstotliwość impulsów lasera i trzy inne wartości obecne w interfejsie oprogramowania: Dyskryminator stałych frakcji (CFD), Time-to-Amplitude (TAC) oraz Przetwornik analogowo-cyfrowy (ADC).
   UWAGA: Laser powinien mieć maksymalną bramkę 1 x 10⁸ pojedynczych fotonów. Liczba ta reprezentuje maksymalną liczbę fotonów dostarczanych przez laser. CFD dostarcza informacji o odbiorze impulsu pojedynczego fotonu w odniesieniu do impulsu laserowego przez detektor. Ta wartość powinna wynosić mniej więcej 1 x 10⁵. TAC rozróżnia czas wykrycia jednego fotonu od następnego impulsu laserowego. Na koniec przetwornik ADC przekształca napięcie TAC na sygnał pamięci, który można zapisać. CFD, TAC i ADC powinny mieć podobne wartości, aby zapewnić, że fotony emitowane przez fluorofor nie zostaną utracone. Prawidłowa ocena tych parametrów zapewnia, że zbierana jest wystarczająca ilość fotonów, aby stworzyć dokładną mapę czasu życia.
7. W interfejsie oprogramowania FLIM wyświetl podgląd liczby wykrytych fotonów: wartość ADC powinna mieścić się w przedziale 1 x 10⁴ i 1 x 10⁵. W razie potrzeby przenieś ostrość na inną płaszczyznę lub zwiększ moc lasera, aby zebrać więcej fotonów.
   UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, liczba rejestrowanych fotonów na sekundę nie powinna przekraczać 1% częstotliwości powtarzania lasera.
8. Na pasku menu wybierz kartę, aby ustawić parametry pozyskiwania. Wybierz skanuj synchronizację w, aby umożliwić wykrywanie pojedynczych fotonów.
9. Ustaw akwizycję na określony czas lub ustaloną liczbę fotonów. Na przykład uzyskaj krzywą rozpadu czasu życia przez 2 minuty lub do momentu, gdy pojedynczy piksel osiągnie liczbę fotonów wynoszącą 2 000 pojedynczych zdarzeń. Naciśnij Start, aby rozpocząć pobieranie.
   UWAGA: Różne fluorofory będą wymagały różnych laserów i filtrów wzbudzających i emisyjnych. W zależności od jasności próbki moc lasera można również regulować, co nie będzie kolidować z żywotnością. Protokoły te używają następujących ustawień wzbudzenia/emisji: YFP ex500/em520-50 nm, mRFP ex561/em580-620 nm. Do pomiarów CFP przy użyciu ex800/em440 nm wykorzystano impulsowy laser dwufotonowy. Ilość czasu i liczba fotonów wymagane do uzyskania mapy FLIM będzie musiała zostać empirycznie ustalona dla każdej konfiguracji i każdego celu eksperymentalnego.

2. Analiza danych FLIM za pomocą oprogramowania FLIMfit

UWAGA: Wykonaj analizę danych za pomocą narzędzia programowego FLIMfit opracowanego w Imperial College London (patrz Rysunek 1).

1. Otwórz oprogramowanie i zaimportuj pliki danych FLIM za pomocą File | Załaduj dane FLIM. Załaduj wszystkie próbki z jednego warunku, nawet jeśli zostały uzyskane w różnych sesjach i z różnych powtórzeń biologicznych.
2. Jeśli to konieczne, podziel pojedynczego nicienia na segmenty z dowolnego zdjęcia FLIM za pomocą Segmentacja | Menedżer ds. segmentacji. Przeciągnij narzędzie do przycinania wokół obszaru zainteresowania, aż zostanie podświetlone. Po zakończeniu naciśnij OK.
   UWAGA: Segmentacja musi być wykonana dla wszystkich obrazów.
3. Wybierz mały obszar, w którym pojawia się obraz oparty na intensywności C. elegans} ({Rysunek 1, Strzałki 1). Krzywa zaniku tego obszaru pojawi się w dużym oknie zaniku po prawej stronie interfejsu (Rysunek 1, Strzałka 2).
   UWAGA: Rozkład może być wyświetlany liniowo lub logarytmicznie.
4. Ustaw prawidłowe parametry, aby ekstrapolować żywotność za pomocą algorytmu oprogramowania, zgodnie z opisem w krokach 2.5-2.8.
5. Na karcie Data (Rysunek 1, strzałka 3):
   1. Ustaw dowolną wartość Zintegrowane minimum, aby wykluczyć wszystkie piksele, które są zbyt ciemne, aby utworzyć dobre dopasowanie. W zależności od próbki C. elegans wartość ta waha się od 40 do 300. Wprowadzaj różne wartości, aż do uzyskania zadowalającego podglądu.
   2. Wybierz liczbę Time Min i Time Max, aby ograniczyć sygnał FLIM do tych wartości. Wszystkie zdarzenia, które pojawiają się przed i po tym progu, zostaną wykluczone.
      UWAGA: Na przykład do analizy mRFP wykluczono zdarzenia przed 800 ps i po 4,000 ps. Wartości te zależą od żywotności fluoroforu i muszą być określone przez użytkownika końcowego.
   3. Nie zmieniaj ustawienia Counts/Photon z 1.
   4. Wprowadź Częstotliwość powtarzania, w MHz, lasera używanego podczas akwizycji.
      UWAGA: W obecnym protokole wykorzystano różne lasery o różnej częstotliwości powtarzania. Laser dwufotonowy używany do akwizycji czasów życia CFP ma częstotliwość powtarzania 80 MHz, dla YFP laser powtarza się z częstotliwością 40 MHz, a dla mRFP wartość ta wynosi 78,01 MHz. Wartości te zostały wprowadzone do FLIMfit zgodnie z analizowaną próbką.
   5. Wprowadź wartość Gate Max, aby wykluczyć wszystkie nasycone piksele.
      UWAGA: Dla pomiarów czasu życia w C. elegans, ta wartość jest ustawiana na dowolną dużą liczbę (np. 1 x 10⁸).
6. Na karcie Lifetime wybierz dopasowanie globalne, które ma zostać użyte (np. dopasowanie pikselowe). Zobacz Rysunek 1, strzałka 4.
   UWAGA: A Dopasowanie pikselowe spowoduje powstanie zaniku dopasowanego do każdego pojedynczego piksela. Dopasowanie Image-wise stworzy globalne dopasowanie każdego pojedynczego obrazu i wyświetli pojedynczą wartość czasu życia dla każdego obrazu. Dopasowanie Globalnie wygeneruje pojedyncze dopasowanie w całym zbiorze danych. Dla wszystkich obrazów podawana jest jedna wartość okresu istnienia.
7. Nie zmieniaj żadnego innego parametru z wyjątkiem Nie. Exp wyboru, jeśli wiadomo, że wybrany rozpad fluorescencji jest wielowykładniczy i wykazuje więcej niż jeden czas życia.
   UWAGA: W niniejszym protokole funkcja ta została wykorzystana do obliczenia czasu życia dwuwykładniczego fluoroforu CFP.
8. Prześlij IRF za pomocą menu IRF: IRF | Załaduj IRF. Aby oszacować przesunięcie IRF, wybierz IRF | Oszacuj przesunięcie IRF. Zestaw wartości pojawi się automatycznie na karcie IRF. Po ustaleniu tego nie zmieniaj żadnych innych parametrów tej zakładki.
9. Gdy wszystkie parametry zostaną ustawione, naciśnij Fit Dataset (Rysunek 1, Strzałka 5). Algorytm określi dopasowanie do krzywej zaniku i ustali wartość czasu życia dla każdego obrazu.
   UWAGA: Wynikowe dopasowanie, zaznaczone niebieską linią, powinno pokrywać się ze wszystkimi zdarzeniami. Dobre dopasowanie uzyskuje się, gdy wszystkie zdarzenia są wyrównane wzdłuż dopasowania.
10. Kliknij zakładkę Parameters (Rysunek 1, strzałka 6), znajdujący się w prawym górnym menu interfejsu oprogramowania, i wybierz Statystyka: w_mean (średnia ważona) i sprawdź, czy chi2{{ TAG_598}} jest jak najbardziej zbliżona do 1.
    UWAGA: A chi2 blisko jednego zapewnia dokładność dopasowania. Wartość życiowa wybranego obrazu jest zatem ujawniana jako tau_1.
11. Eksportuj dowolne informacje, które Cię interesują: Plik | Eksportuj obrazy intensywności/Tabela wyników dopasowania/Obrazy/Histogramy. Zapisz ustawienia danych używane do obliczenia okresu istnienia: Plik | Zapisz ustawienia danych.
    UWAGA: Zastosowane parametry zostaną zapisane do przyszłej analizy wybranych próbek.

3. Graficzne reprezentacje danych FLIM

UWAGA: Czasy życia zebrane z różnych próbek można przedstawić wizualnie na różne sposoby. Wybierz, aby oznaczać wartości okresu istnienia w nanosekundach lub pikosekundach.

1. Pokaż jakość dopasowania i dokładność krzywej, eksportując krzywą zaniku bezpośrednio z FLIMfit.
2. Przedstaw rozkład fotonów, wykreślając częstotliwość liczby fotonów w funkcji wartości czasu życia na histogramie.
3. Na koniec, w celu porównania statystycznego, w przypadku porównywania dwóch lub więcej próbek, umieść wartości czasu życia oraz odchylenie standardowe średniej na wykresie słupkowym wykresu punktowego. Wykonaj dowolną analizę statystyczną.

Wyniki

Materiały