Mikroskopia dwufotonowa do monitorowania dynamiki wapnia w fotoreceptorach czopków siatkówki myszy

Streszczenie

Źródło: Kulkarni, M. et al. Obrazowanie ca²⁺ Dynamika w stożku fotoreceptorów zakończeń aksonów siatkówki myszy. J. Vis. Exp. (2015)

Ten film demonstruje zastosowanie mikroskopii dwufotonowej do monitorowania dynamiki wapnia w fotoreceptorach czopków transgenicznej siatkówki myszy. Przedstawiono w nim etapy przygotowania wycinków siatkówki, obrazowania biosensorów wapnia opartych na FRET oraz analizy zmian fluorescencji w celu ilościowego określenia poziomu wapnia przy oświetleniu tła i stymulacji świetlnej.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Przygotowanie plastrów (10 - 15 min)
   1. Przygotuj wcześniej nitrocelulozowe membrany filtracyjne do krojenia siatkówki oraz szklane szkiełka nakrywkowe do montażu plastrów i przenoszenia ich do komory nagrywającej. Pokrój nitrocelulozową membranę filtracyjną na prostokątne kawałki o wymiarach około 10 x 5 mm za pomocą nożyczek. Pokrój szkiełka nakrywkowe na prostokątne kawałki o wymiarach około 10 x 5 mm za pomocą noża do szkła.
   2. Powoli zanurz szklane szkiełko w roztworze zewnątrzkomórkowym w pobliżu tkanki. Delikatnie przeciągnij plasterek siatkówki uzyskany z myszy z biosensorem HR2.1:TN-XL Ca²⁺ na szklane szkiełko stroną z komórką zwojową do góry, chwytając go na samej krawędzi za pomocą kleszczy. Proces ten zmniejsza uszkodzenia mechaniczne i fałdowanie tkanki.
   3. Wybierz obszar siatkówki, który jest związany z odpowiednim pytaniem badawczym. Wytnij prostokątny kawałek o wymiarach około 1 x 2 mm z wybranego obszaru siatkówki za pomocą zakrzywionego ostrza skalpela. Zetrzyj nadmiar roztworu wokół tkanki.
   4. Umieść membranę filtracyjną na kawałku siatkówki tak, aby strona komórek zwojowych przylegała do membrany. Natychmiast dodaj kroplę pożywki zewnątrzkomórkowej na błonę, aby mocno przymocować tkankę do błony.
   5. Przenieś tkankę siatkówki zamontowaną na błonie do komory krojenia zawierającej świeży roztwór zewnątrzkomórkowy.
   6. Pokrój siatkówkę na pionowe plastry o grubości 200 μm (Rysunek 1B) za pomocą świeżej żyletki przymocowanej do rozdrabniacza tkanek. Wymień ostrze dla każdego elementu siatkówki.
      Uwaga: Żyletka musi być idealnie wyrównana z powierzchnią dna komory krojenia, tak aby cała membrana pękała jednocześnie, na co wskazuje dźwięk "klikania" podczas cięcia. W przeciwnym razie ostrze może się wygiąć i uszkodzić plasterek.
   7. Przyklej pojedynczy plasterek zamontowany na membranie do szklanego szkiełka nakrywkowego, nakładając smar wysokopróżniowy tylko na końce membrany (Rysunek 1C). Utrzymuj szklaną powierzchnię poniżej siatkówki w stanie wolnym od tłuszczu.
   8. Plastry nakryte szkiełkiem nakrytym kroplą roztworu zewnątrzkomórkowego należy przechowywać w komorze przetrzymywania – zamkniętym i nieprzepuszczającym światła pojemniku, np. szalce Petriego z pokrywką pokrytą folią aluminiową – w atmosferze karbtlenu w temperaturze pokojowej (RT). Wprowadź tlen węglowy, bulgocząc w małym zbiorniku wodnym, aby utrzymać wilgotność atmosfery w komorze przetrzymywania; Zapobiega to wysychaniu plastrów.
   9. Pozostaw plastry w komorze na 10 - 15 minut przed przeniesieniem ich (jeden po drugim) do komory nagrywania. Plastry można przechowywać do 4-5 godzin w komorze przechowywania w temperaturze pokojowej (~21 °C).

2. Obrazowanie dwufotonowe Ca²⁺

1. Mikroskopia dwufotonowa
   1. Użyj mikroskopu dwufotonowego z ruchomym mikroskopem obiektywowym (MOM).
      Uwaga: Można użyć dowolnego pionowego mikroskopu dwufotonowego, który spełnia następujące minimalne wymagania: Musi być wyposażony w (a) impulsowy laser strojony do ~860 nm, (b) minimum dwa jednocześnie nabyte kanały fluorescencyjne, (c) filtry do wzmocnionego białka cyjanowego (eCFP) i fluorescencji cytrynu, (d) stymulator światła, oraz (e) oprogramowanie, które pozwala na nagrywanie sekwencji obrazów poklatkowych z częstotliwością klatek wystarczającą do rozpoznania interesujących sygnałów Ca²⁺.
   2. Uruchom system obrazowania dwufotonowego zgodnie ze wskazówkami producenta. Ściśle przestrzegaj wytycznych dotyczących bezpieczeństwa lasera w obiekcie. Uruchom laser i dostrój go do ~860 nm.
   3. Przenieś plasterek z komory przetrzymywania do komory rejestracyjnej i natychmiast rozpocznij perfuzję z karbotlenowym roztworem zewnątrzkomórkowym. Utrzymać natężenie przepływu perfuzji wynoszące 2 ml/min i temperaturę 37 °C w komorze rejestracyjnej.
   4. Użyj obiektywu 20X 0.95 z aperturą numeryczną (NA) do zanurzenia w wodzie. Jeśli to możliwe, użyj kamery ze sprzężeniem ładunkowym (CCD) w połączeniu z diodą elektroluminescencyjną (LED) na podczerwień poniżej komory nagrywającej, aby zlokalizować wycinek siatkówki (Rysunek 2). W przeciwnym razie zlokalizuj wycinek za pomocą obrazowania dwufotonowego (patrz 2.1.5).
   5. Przełącz się na obrazowanie dwufotonowe, aby wyświetlić ekspresję biosensora. Włącz dwa kanały detekcji do obrazowania fluorescencyjnego eCFP i cytrynu.
   6. Użyj oprogramowania do akwizycji obrazu, które steruje mikroskopem dwufotonowym, aby zeskanować i wybrać rząd końcówek stożkowych do nagrywania (Rysunek 3A). Ustaw akwizycję obrazu na obrazy o rozdzielczości 128 x 16 pikseli (31,25 Hz) lub podobną konfigurację. Ogranicz skanowany obszar do końcówek stożkowych, aby uniknąć wybielania fotopigmentów w zewnętrznych segmentach.
      Uwaga: Dla czujnika wapnia TN-XL (τ = ~0,6 sekundy dla wiązania Ca²⁺, τ = ~0,2 sekundy dla Ca²⁺ bez wiązania) zalecana jest minimalna częstotliwość odświeżania ~8 Hz.
   7. Stymulacja i rejestracja światła
      1. Użyj stymulatora światła pełnopolowego w podstopniu, aby wykonać następujące kroki.
         Uwaga: Prostym rozwiązaniem dla stymulatora światła pełnego pola jest użycie dwóch diod LED z filtrem pasmowo-przepustowym (e.g., "niebieska": 360 pasma przepustowego (BP) 12, "zielona": 578 BP 10), które pasują do czułości długości fal stożków myszy, ale jednocześnie nie pokrywają się z filtrami używanymi do wykrywania fluorescencji. Światło z diod LED jest skupiane przez kondensator przez dno komory nagrywającej (Rysunek 2).
      2. Włączyć laser i pozwolić stożkom dostosować się do lasera skanującego i światła tła bodźca (20 - 30 sekund) przed zaprezentowaniem bodźców świetlnych (patrz 2.2.3) lub zastosowaniem środków farmakologicznych.
      3. Rozpocznij prezentację dowolnych bodźców ( np. błysków światła, jak pokazano na Rysunek 3B, C). W przypadku stymulatora opisanego w kroku 2.2.1 należy wygenerować bodźce, modulując intensywność dwóch diod LED w czasie za pomocą płytki mikroprocesorowej sterowanej przez dostosowane oprogramowanie.
      4. Rozpocznij rejestrację dwóch kanałów fluorescencyjnych (e.g., przy długości fali 483 nm dla "niebieskiego"
   8. Förster resonance energy transfer (FRET)-donor eCFP i przy 535 nm dla "żółtego" akceptora FRET) jednocześnie za pomocą odpowiedniego oprogramowania do akwizycji obrazu (patrz również 2.1.6). Na przykład w przypadku błysków światła (Rysunek 3B, C), nagraj co najmniej 8 - 10 prezentacji bodźców (prób).

Wyniki

Rysunek 1. Przygotowanie pionowych plastrów siatkówki. oraz Izolowana i spłaszczona siatkówka przygotowana do krojenia. oraz Prostokątny kawałek siatkówki (patrz czerwona ramka w A) zamontowany na membranie z bibuły filtracyjn...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Smar wysokopróżniowy	Dow Corning	1018817	http://www.dowcorning.com
Szkiełka nakrywkowe	R. Langenbrinck		24 x 60 mm; http://www.langenbrinck.com
Szkiełka	R. Langenbrinck		76 x 26 mm; http://www.langenbrinck.com
Ostrza do rozdrabniacza tkanek	MARTOR KG	ARGENTAX Nr 1044	0,25 mm; http://www.martor.de
Rozdrabniacz do tkanek	Specjalnie wykonana
membrana filtracyjna nitrocelulozowa z siatką	Merck Millipore	AABG01300	Typ filtra: 0,8 μm; http://www.emdmillipore.com
Stymulator pełnego pola oparty na UV/zielonej diodzie LED	Niestandardowa
płytka mikroprocesora Open source	Arduino		http://www.arduino.cc
Oprogramowanie do obrazowania CfNT	Napisane		Opracowane przez Michaela Müllera, MPI for Medical Research, Heidelberg, Niemcy
IgorPro	Wavemetrics		http://www.wavemetrics.com
Ogniskowa systemu VC3-4 system perfuzyjny	ALA Instrument		Z końcówką o średnicy 100 μm; http://www.alascience.com/
Mai Tai HP DeepSee (laser Ti:Sapphire)	Newport Spectra-Physics		http://www.spectra-physics.com
Ruchomy mikroskop obiektywowy (MOM), zaprojektowany przez W. Denka, MPImF, Heidelberg, Niemcy	Instrumenty		Sutterhttp://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html
Obiektyw XLUMPlanFL 20x/0,95 W	Olympus		http://www.olympusamerica.com
Leica MZ95	Mikrosystemy		http://www.leica-microsystems.com/

na zamówienie naukowy Leica