Obrazowanie żywych komórek migracji jądrowej gleju Mullera podczas regeneracji siatkówki danio pręgowanego

Streszczenie

Źródło: Lahne, M., et.al. Hodowla dorosłych transgenicznych eksplantatów siatkówki danio pręgowanego do obrazowania żywych komórek za pomocą mikroskopii wielofotonowej. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film pokazuje obrazowanie żywych komórek migracji jądrowej gleju Mullera w eksplantatach siatkówki danio pręgowanego osadzonych w agarozie po uszkodzeniu fotoreceptorów wywołanym światłem. Czynnik martwicy nowotworu alfa (TNF-α) uwalniany przez uszkodzone fotoreceptory aktywuje komórki glejowe Mullera, wywołując migrację jądrową przez wewnętrzną i zewnętrzną warstwę jądrową w celu mitozy i generacji neuronalnych progenitorów. Wykonane obrazy ujawniają dynamikę migracji jądrowej i różnicowania się progenitorów podczas regeneracji siatkówki.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Mikroskopia wielofotonowa

UWAGA: Eksperymenty przeprowadzone w tym manuskrypcie zostały zoptymalizowane pod kątem mikroskopu wielofotonowego wyposażonego w laser na podczerwień (patrz Spis materiałów), obiektyw 40X Apo do zanurzenia w wodzie na duże odległości (N.A. 1.15), skaner galwanometryczny i komorę środowiskową, która zawiera wkładkę na cztery szalki Petriego o średnicy 35 mm. Obrazy zostały pozyskane za pomocą detektora non-descanned (R-NDD).

1. Przed obrazowaniem należy zrównoważyć komorę środowiskową, aby osiągnąć 5% CO₂ / atmosferę powietrzną. Upewnij się, że puste szalki Petriego są włożone do uchwytu, aby uniknąć wycieku gazu do pomieszczenia.
2. Włącz system mikroskopowy.
3. Po zrównoważeniu komory środowiskowej dodaj ciecz o współczynniku załamania światła na obiektyw 40X Apo do zanurzenia w wodzie na duże odległości (ND 1.15).
   UWAGA: Ciecz o współczynniku załamania światła o właściwościach optycznych podobnych do wody jest używana w celu uniknięcia parowania wody podczas długotrwałego obrazowania.
4. Umieść fluorodiaki z eksplantatami siatkówki w komorze. Używając światła jasnego pola, ustaw próbkę na ścieżce światła i przenieś środkowy obszar siatkówki grzbietowej do płaszczyzny ostrości.
5. Użyj światła epifluorescencyjnego GFP, aby ustawić ostrość na jądrach gleju Müllera gfap:nGFP-dodatnich (Figura 1A, C).
   UWAGA: Jeśli eksplantaty nie są zamontowane płasko lub agaroza nagromadziła się pod eksplantatem, trudno będzie skupić się na jądrach gfap:nGFP-dodatnich lub będą one słabo fluoryzować.
   1. Sprawdź, czy przeniesienie do innego regionu w obrębie tego samego eksplantatu siatkówki rozwiąże problem z ostrością. W przeciwnym razie przenieś się do innego eksplantatu siatkówki.
6. W oprogramowaniu do akwizycji obrazu otwórz okna "A1 MP GUI", "TiPad", "A1 Compact GUI" i "Akwizycja ND". W przypadku obrazowania wielofotonowego upewnij się, że opcja "IR NDD" jest wybrana w "Kompaktowym graficznym interfejsie użytkownika A1".
7. W polu "ustawienia" wybierz IR-DM dla 1. zwierciadła dichroicznego i wybierz filtr pasmowoprzepustowy 525/50, aby uzyskać fluorescencję GFP.
8. Włącz laser IR w oknie oznaczonym "A1MP GUI". Zajmie to kilka minut, zanim laser będzie gotowy. Ustaw długość fali na 910 nm, aby wzbudzić fluorescencję GFP i wyrównaj laser, klikając przycisk "Automatyczne wyrównanie" w oknie "A1 MP GUI".
9. Upewnij się, że światła w pomieszczeniu i sprzęcie są wyłączone lub zasłonięte przed otwarciem migawki w "graficznym interfejsie użytkownika A1 MP", aby uniknąć prześwietlenia lampy fotopowielacza. Aby zmniejszyć poziom hałasu, mikroskop należy umieścić w zaciemnionym otoczeniu.
10. Uzyskuj obrazy o polu widzenia 300 x 300 pikseli, przy dwukrotnym powiększeniu i czasie przebywania pikseli 4,8 μs/piksel. Z grubsza ustaw moc lasera, zmieniając "obszar akwizycji" w "graficznym interfejsie użytkownika A1MP" i wzmocnienie w oknie "A1 Compact GUI".
11. Ustawianie z-stack
    1. Skoncentruj się na warstwie komórek zwojowych (GCL), aby ustawić górną płaszczyznę ogniskową stosu z w oknie podrzędnym 'z' w oknie 'ND acquisition'. Niektóre komórki gfap:nGFP-dodatnie są zwykle zlokalizowane w warstwie komórek zwojowych, co pomaga zidentyfikować podstawową granicę siatkówki (ryc. 1A, D).
    2. Przesuń płaszczyznę ogniskowej przez poziom zewnętrznej warstwy jądrowej (ONL) (rysunek 1A, B), która charakteryzuje się obecnością słabo oznaczonych komórek gfap:nGFP-dodatnich, które są okrągłe i powiększone w stosunku do ich odpowiedników w wewnętrznej warstwie jądrowej (INL) (rysunek 1A, C).
    3. Ustaw tę płaszczyznę jako dolną część stosu z. Upewnij się, że cały ONL zostanie zobrazowany (Rysunek 1A, B).
    4. W przypadku wystąpienia przesunięć płaszczyzny ogniskowej, które wymagają ponownej regulacji w okresie obrazowania, kliknij dwukrotnie środkową pozycję w oknie podrzędnym "z", aby przypisać ją jako pozycję "domową". Zmień na "zdefiniowany tryb symetryczny" i kliknij "względny".
    5. Ustaw rozmiar kroku Z w zakresie od 0,7 do 1 μm.
12. Korekcja intensywności Z:
    1. Zastosuj korekcje intensywności z, aby skompensować utratę intensywności pikseli spowodowaną rozpraszaniem światła podczas obrazowania w głębokich warstwach tkanki.
    2. Aby ustawić korekcję, otwórz okno "Korekcja intensywności z". Aby ustawić 'zakres z-stack', wybierz 'From ND'.
    3. Kliknij dolną płaszczyznę ogniskowej w oknie "Korekcja intensywności z" (w tym przypadku odpowiada warstwie komórek zwojowych) i ustaw intensywność lasera ("obszar akwizycji" w "A1MP GUI") i wzmocnienie (A1 Compact GUI).
    4. Kliknij strzałkę obok "wartości z" w oknie "korekcja intensywności z", aby potwierdzić ustawienia, które są następnie wyświetlane w sekcji "ustawienia urządzenia" w oknie "korekcja intensywności z" dla wybranej płaszczyzny ogniskowej.
    5. Powtórz proces dla środkowej i górnej płaszczyzny, zwiększając moc i wzmocnienie lasera. W razie potrzeby można dodać dodatkowe płaszczyzny ogniskowych. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z konkretnymi ustawieniami lasera i wzmocnienia dla eksperymentów na rysunkach 1 - 3.
    6. Ustaw "obszar akwizycji" w oknie "A1 MP GUI". Unikaj wybierania obszaru akwizycji większego niż 15 i wzmocnienia wyższego niż 126 na początku obrazowania, aby uniknąć fotowybielania i zwiększonego poziomu szumów.
       UWAGA: Ponieważ lasery i lampy fotopowielacza różnią się między systemami mikroskopowymi, przetestuj ustawienia lasera i wzmocnienia, aby uzyskać optymalne warunki obrazowania dla konfiguracji mikroskopu, unikając fotowybielania.
    7. Wybierz "korekcja intensywności względnej" w oknie "korekcja intensywności z".
13. W podoknie "szeregi czasowe" w oknie "Akwizycja ND" ustaw czas trwania na 8 godzin, a interwał na "bez opóźnienia". Następnie upewnij się, że kliknąłeś "Uruchom korektę z" w oknie podrzędnym "z-stack" w przycisku "Akwizycja ND", aby uzyskać szeregi czasowe 3D.
14. Utrzymuj eksplantaty siatkówki w temperaturze 27 - 29 °C przez cały czas pozyskiwania obrazu.
15. Przez cały okres akwizycji obrazu, jeśli to konieczne, należy ponownie dostosować poziom mocy i wzmocnienie, aby utrzymać jakość obrazu do analizy po obrazowaniu. W celu regulacji wykonaj kroki 1.11.2 - 1.11.4.
16. Jeśli płaszczyzna ogniskowej przesunie się, wstrzymaj lub zatrzymaj bieg i ponownie wykonaj krok 1.11.
    UWAGA: Jeśli w kroku 1.12.7 wybrano "względną korekcję z" i wykonano krok 1.11.4, nie powinno być konieczne ponowne dostosowanie poziomów mocy i wzmocnienia, chyba że wystąpiło rozległe fotowybielanie.

Tabela 1: Poziomy lasera i wzmocnienia używane do korekcji intensywności Z na różnych płaszczyznach w eksperymentach przedstawionych na rysunkach 1 - 3.

	Tg[gfap:EGFP]nt11		Tg[rho:Eco.NfsB-EGFP]nt19
	Moc lasera	Zysk	Moc lasera	Zysk
Góra (fotoreceptor pręcikowy)	13	126	3.5	118
Środkowy (glej Mullera)	10	126	2.8	118
Dół (warstwa komórek zwojowych)	8	126	2.1	118

Wyniki

Rycina 1: Rekonstrukcja 3D wielofotonowych stosów Z-Stack siatkówki. A) Rekonstrukcja 3D wielofotonowej serii obrazów stosu z gfap:nGFP-dodatnich w całych hodowlach siatkówki od danio pręgowanego po 48 godzinach uszkodzeń świetlnych.

Materiały