Obrazowanie uszkodzenia mózgu wywołanego niedotlenieniem-niedokrwieniem mózgu w modelu mysim

Streszczenie

Źródło: Ouyang, Y., i wsp. Jednoczesne obrazowanie PET/MRI podczas niedotlenienia mózgu myszy. J. Vis. Exp. (2015)

Ten film przedstawia technikę oceny uszkodzenia niedotlenienia mózgu za pomocą jednoczesnej pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) i rezonansu magnetycznego (MRI). Znieczulona mysz przechodzi podwiązanie wspólnej tętnicy szyjnej (CCA), zmniejszając przepływ krwi do jednej półkuli mózgu i predysponując ją do uszkodzenia wywołanego niedotlenieniem. Obrazowanie PET i MRI ocenia metabolizm glukozy i zmiany strukturalne podczas niedotlenienia. MRI wykrywa ograniczoną dyfuzję wody, podczas gdy PET ujawnia zmniejszony wychwyt glukozy, co wskazuje na stres komórkowy wywołany niedotlenieniem i upośledzenie metaboliczne.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Jednostronne podwiązanie tętnicy szyjnej wspólnej (CCA)

1. Przygotuj sterylne pole ze sterylizowanymi narzędziami chirurgicznymi i materiałami w dogodnym miejscu. Upewnij się, że poduszka grzewcza jest podgrzana do 37 °C z sondą temperatury umieszczoną bezpiecznie na podkładce. Pamiętaj, aby użyć sterylnej serwety, aby zakryć pole operacyjne.
2. Znieczulić zwierzę (izofluran, 1-3% w powietrzu o stężeniu 0,5-1 l/min) i ułożyć zwierzę w pozycji leżącej z ogonem skierowanym na zewnątrz. Sprawdź znieczulenie, szczypiąc palec u nogi - nie powinno to wywołać żadnej reakcji, jeśli zwierzę jest odpowiednio znieczulone. Nałóż maść okulistyczną na oczy.
3. Nałóż krem do depilacji na dolną część szyi i górną część klatki piersiowej za pomocą 1-2 bawełnianych wacików. Odczekaj 1-3 minuty, a następnie usuń włosy i krem za pomocą mokrej gazy lub wacików nasączonych alkoholem. Przetrzyj obszar nacięcia Betadine w sposób okrężny od wewnątrz na zewnątrz, a następnie zmień na sterylne rękawiczki chirurgiczne.
4. Za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie o długości około 1 cm wzdłuż linii środkowej dolnej części szyi. Ostrożnie oddziel zewnętrzną skórę od otaczającej powięzi za pomocą nożyczek chirurgicznych.
5. Za pomocą dwóch kleszczyków do szycia mikrotęczówki McPhersona oddziel prawą tętnicę szyjną wspólną od powięzi, uważając, aby nie uszkodzić żył lub nie naruszyć nerwu błędnego.
6. Używając kleszczy po prawej stronie, wysuń na zewnątrz prawe CCA w stabilnej pozycji. Zastosuj kilka kropli soli fizjologicznej, aby zapobiec wysuszeniu. Przełóż odpowiednią długość (2-3 cm) jedwabnego szwu 6-0 pod prawym CCA i podwiązaj za pomocą podwójnego kwadratowego węzła. Opcjonalnie ponownie podwiązać za pomocą drugiej długości jedwabnego szwu 6-0.
7. Zmień położenie prawego CCA i usuń nadmiar płynu z otwarcia za pomocą sterylnego wacika z końcówką gąbki. Zamknij nacięcie jedwabnym szwem 6-0. Lidokainę stosować miejscowo w dawce do 7 mg/kg.
8. Pozwól zwierzęciu dojść do siebie po znieczuleniu do czasu rozpoczęcia ruchu ambulatoryjnego (około 30 minut) i przeprowadź monitorowanie pooperacyjne do momentu, gdy zwierzę będzie gotowe do obrazowania.

2. Przygotowanie do obrazowania: Kontrole systemu i sprzętu Skonfiguruj

1. sprzęt i oprogramowanie dla systemów MRI i PET oraz sprawdź ich funkcjonalność w następujący sposób. Upewnij się, że wszystkie połączenia fizyczne są bezpieczne, a ustawienia oprogramowania są odpowiednio wybrane.
   1. Upewnij się, że system PET ma zalecaną temperaturę roboczą 5 °C za pomocą systemu chłodzenia powietrzem.
   2. Zamontuj system PET wewnątrz otworu MRI, wyrównując środki pola widzenia PET i MRI (FOV) przy użyciu znanych przesunięć osiowych. Zamontuj cewkę MRI wewnątrz otworu systemu PET i wyśrodkuj cewkę z systemem PET i centrami magnesów MRI.
   3. Włącz elektronikę PET dla zasilania i napięcia polaryzacji (Uwaga: kroki będą się różnić w zależności od instrumentu). Wykonaj szybkie (5 minut) skanowanie za pomocą butli 68Ge i sprawdź wynikowy sinogram, aby upewnić się, że wszystkie detektory są sprawne.
   4. Opcjonalnie należy pozyskać dane, które mają być wykorzystane w matrycy transformacji PET/MRI do celów wspólnej rejestracji: Wypełnić trójwymiarowy fantom (np. trzy wypełnione kulki) 200 μCi roztworu wodnego 18F i pobierać przez 15 minut za pomocą PET. Uzyskaj anatomiczne dane MRI: w oknie Scan Control (Sterowanie skanowaniem) wybierz sekwencję multi-slice multi-echo (MSME) (patrz Tabela 1). Powtórz dla wszystkich trzech głównych orientacji: osiowej, strzałkowej i czołowej.
2. Sprawdź ustawienia i działanie pompy infuzyjnej. Ustawić pompę na 4,44 μl na minutę, co w ciągu 45 minut ciągłego wlewu dostarcza całkowitą objętość 200 μl, typowy zalecany limit dla wstrzyknięć dożylnych (dożylnych) u zwierzęcia o masie 20 g.
3. Sprawdź działanie grzałki i upewnij się, że temperatura wyjściowa jest wystarczająca do utrzymania zwierzęcia w cieple (37 °C). Sprawdź, czy monitorowanie temperatury i oddechu jest włączone, przygotowując się do umieszczenia zwierzęcia na łóżku dla zwierząt.
4. Sprawdź działanie przepływomierzy O2 i N2 (dla 0,5 l/min: O2 przy 57,2 mg/min i N2 przy 0,575 g/min), włączając oba przy wyłączonym źródle sprężonego powietrza i włączonych źródłach O2 i N2. Aby uniknąć ryzyka uszkodzenia przepływomierzy, nie włączaj ich bez wystarczającego ciśnienia wejściowego.
5. Upewnij się, że parownik izofluranu jest wystarczająco napełniony. Przed przystąpieniem do obrazowania należy rozpocząć przepływ znieczulenia izofluranem na poziomie 1-2% i 0,5 do 1 l/min.
6. Przygotuj legowisko dla zwierząt, upewniając się, że systemy znieczulające, podkładki oddechowej i podgrzewacze są bezpiecznie ustawione i działające. W celu zwiększenia dokładności korejestracji PET/MRI, markery odniesienia (np. rurki kapilarne wypełnione radioznacznikiem o stężeniu podobnym do wstrzykiwanego w celu obrazowania) mogą być przymocowane do łóżka zwierzęcia w polu widzenia.

3. Przebieg obrazowania

Po zakończeniu wszystkich niezbędnych kontroli sprzętu przejdź do obrazowania w następujący sposób:

1. Znieczulij zwierzę izofluranem i wprowadź cewnik do żyły ogonowej (igła 28 G, rurka PE-10 mniejsza niż 5 cm) wypełniony heparynizowaną solą fizjologiczną (0,5 ml heparyny, 1,000 USP/ml, w 10 ml soli fizjologicznej). Ogrzanie zwierzęcia i/lub ogona może poprawić dokładność wprowadzania cewnika. Opcjonalnie umieść kroplę kleju cyjanoakrylowego w miejscu wprowadzenia, aby zabezpieczyć linię dożylną.
2. Przenieś zwierzę na przygotowane legowisko dla zwierząt. Upewnij się, że głowa zwierzęcia jest bezpieczna, z górnymi siekaczami zabezpieczonymi listwą zębatą i nausznikami na miejscu, jeśli są używane.
3. Nałóż maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Włóż termometr z sondą doodbytniczą. Upewnij się, że odczyty temperatury i oddechu działają.
4. Pobrać dawkę radioznacznika (około 600 μCi na 200 μl), która ma być wstrzyknięta do heparynizowanego rurki PE-10 o odpowiedniej długości – około 3 m dla rurki PE-10 i objętości 200 μl. Podłączyć jeden koniec tej rurki do strzykawki pompy infuzyjnej, a drugi do przewodu cewnika do żyły ogonowej, uważając, aby nie spowodować przebić rurki.
5. Wsuń legowisko zwierzęcia do przodu do otworu magnesu, uważając, aby nie zakłócić ustawienia cewki MRI i żadnych przewodów lub kabli, zwłaszcza rurki anestezjologicznej. Upewnij się, że środek mózgu jest wyrównany ze środkami cewki MRI, systemu PET i magnesu MRI.
6. Wykonaj strojenie i dopasowanie cewki MRI, obracając pokrętła regulacyjne na cewce, minimalizując niedopasowania impedancji (sprawdź specyfikację cewki) i częstotliwości (300 MHz przez 1 godzinę przy 7 Teslach), obserwując wyświetlacz przedwzmacniacza dużej mocy.
7. (MRI) Po dostrojeniu i dopasowaniu uzyskaj obraz zwiadowczy: wybierz sekwencję tripilota Rapid Imaging with Refocused Echoes (RARE) i uruchom sekwencję w oknie sterowania skanowaniem. Sprawdź pozycję zwierzęcia, powtarzając kroki 3.5 i 3.6 w razie potrzeby. Zresetuj podkładki regulacyjne do wartości zerowej.
8. (MRI) Wykonać zlokalizowany, punktowo-rozdzielczy skan spektroskopowy (PRESS) w objętości w mózgu: Uruchom sekwencję PRESS (patrz Tabela 1) w objętości prostokątnej o wymiarach 3,9 mm × 6 mm × 9 mm. Sprawdź szerokość linii wodnej za pomocą makropolecenia CalcLineWidth. Jeśli dopuszczalna jest wartość pełnej szerokości przy połowie maksimum (FWHM) (np. 0,2 ppm), przejdź do kroku 3.10. Jeśli nie, przejdź do kroku 3.9.
9. (MRI) Uzyskaj mapę pola: Uruchom sekwencję FieldMap (patrz Tabela 1). Uzyskanych danych można użyć dla podkładki rzutowania pod wieloma kątami (MAPSHIM), uruchamiając makro MAPSHIM i wybierając korekty lokalne liniowe i drugiego rzędu (z2). Powtórz krok 3.8.
10. (MRI) Ustaw plan wycinków dla skanowania obrazowania dyfuzyjnego (DWI) (patrz Tabela 1): za pomocą Edytora geometrii upewnij się, że pole widzenia akwizycji jest ustawione tak, aby uzyskać pożądaną objętość zainteresowania w mózgu. Jeśli wynikowy plan przekrojów jest wyrównany zgodnie z potrzebami, skopiuj ten plan przekrojów w oknie Kontrola skanowania dla wszystkich kolejnych skanów DWI. Rozpocznij nabywanie.
11. (PET) Po przygotowaniu i przygotowaniu do rozpoczęcia pobierania PET uruchomić pompę infuzyjną. Po upływie z góry ustalonego opóźnienia, w którym wstrzyknięto sól fizjologiczną z cewnika, należy rozpocząć akwizycję PET (patrz Tabela 1) w celu wychwycenia wejścia radioznacznika. Należy monitorować szybkość zliczania i zwracać uwagę na stopniowy wzrost liczby wskazujący na udane wstrzyknięcie.
12. Po 10-15 minutach rozpocznij wyzwanie hipoksyjne równolegle z krokiem 3.12. Aby zainicjować prowokację hipoksyjną, wyłącz przepływ powietrza medycznego i natychmiast włącz przepływomierze O2 i N2 z ustalonymi ustawieniami, aby dostarczyć 8% tlenu i 92% azotu oraz zredukować izofluran do 0,8%. Nie włączaj przepływomierzy bez ciśnienia wejściowego.
13. (MRI) W tym samym czasie, co w kroku 3.12, rozpocznij akwizycję DWI przygotowaną w kroku 3.10 (skan "H1").
14. (MRI) Rozpocznij akwizycję DWI (skan "H2"), przygotowany w kroku 3.10, natychmiast po zakończeniu skanowania H1. Zakończ problem niedotlenienia, wyłączając przepływomierze, przywracając przepływ powietrza medycznego i przywracając stężenie izofluranu do odpowiedniej wartości w oparciu o monitorowanie fizjologiczne.
15. (MRI) Uzyskaj skan DWI po niedotlenieniu przygotowany w kroku 3.10. Wyłączyć pompę infuzyjną po zakończeniu tego skanowania.
16. (MRI) Uzyskaj obrazy anatomiczne w płaszczyźnie osiowej i strzałkowej. W oknie Scan Control (Okno sterowania skanowaniem) wybierz sekwencję MMŚP (patrz Tabela 1). Korzystając z Edytora geometrii, upewnij się, że pole widzenia akwizycji obejmuje mózg.
17. Usunąć zwierzę, wrócić do klatki podczas chodzenia i monitorować oznaki choroby, w razie potrzeby poddać eutanazji z podaniem CO2, a następnie zwichnięciem szyjki macicy jako metodą wtórną.

Tabela 1. Parametry sekwencji impulsów MRI dla skanów opisanych w protokole oraz parametry akwizycji, histogramu i rekonstrukcji PET.

Parametry pozyskiwania obrazowania i dyfuzja akwizycji
MRI (EPI-DWI)
Czas pozyskiwania	15 min
Rozmiar matrycy	256 x 64
Plastry	10
FOV	30 x 14 x 8 mm
Rozmiar woksela	0,117 x 0,219 x 0,8 mm
Efektywna szerokość pasma spektralnego	150 kHz
TE	41 ms
TR	3,000 msec
Średnie	6
segmentów k-space	16
wartości b	0, 400, 800 s/mm2
Anatomiczny rezonans magnetyczny (MMŚP)
Czas akwizycji	5 min
Rozmiar matrycy	256 x 256
Plastry	16
FOV	30 x 22 x 12,8 mm
Rozmiar woksela	0,117 x 0,086 x 0,8 mm
TE	14 ms
TR	1,000 ms
1	powtórzenia
	1
Punktowo-rozdzielczy skan spektroskopowy (PRESS)
Czas akwizycji	15 s
Rozmiar woksela	3,9 x 6 x 9 mm
TE	20 ms
TR	2,500 ms
Średnie	6
FieldMap
Czas akwizycji	1 min 21 s
1. TE	1,49 ms
2. TE	5,49 ms
TR	20 ms
Średnie	1
Akwizycja PET, histogram, i Parametry rekonstrukcji
Tracer	[18F]FDG
Szybkość infuzji	4,44 μL/min
Czas akwizycji	60 min
Rozmiar obrazu na plasterek	128 x 128
Plasterki	99
Rozmiar woksela	0,4 x 0,4 x 0,6 mm
Dynamiczne kadrowanie	12 x 300 s
Typ rekonstrukcji	OS-MLEM (6 podzbiorów, 6 iteracji)

sprzętuŚrednie

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Chirurgia
Nożyczki chirurgiczne	Roboz	RS-5852
Kleszcze	Roboz	RS-5237
Kleszcze do komarów Hartman	Miltex	7-26
2x kleszcze do szycia McPherson, 8,5 cm	Dokładne instrumenty chirurgiczne i naukowe	4473	Przydatne jest zmniejszenie szerokości otworu za pomocą opaski na kleszczach używanych do przytrzymywania tętnicy szyjnej
6-0 pleciony jedwabny szew powlekany silikonem z igłą 3/8 C-1	Covidien Sofsilk	S-1172
koców homeotermicznych	Aparat Harvarda	507220F
Super klej	(ogólny)
Przepływomierz hipoksji
do O₂Alicat	Scientific	MC-500SCCM-D
Flometr do N₂	Alicat Scientific	MC-5SLPM-D O
₂ miernik	MSA	Altair Pro
Obrazowanie
7.05 System rezonansu magnetycznego Tesli	Bruker	BioSpec	20 cm średnica otworu wewnętrznego z zestawem gradientowym. Oprogramowanie Paravision 5.1.
Objętość cewki Tx/Rx 1H, 35mm ID	Bruker	T8100
	(wewnętrzny)		Detektory 4x24 LSO-PSAPD,
matryca 10x10 LSO na detektor,
rozstaw kryształów 1,2 mm i głębokość 14 mm. PSAPD 14 x 14 mm. Pole widzenia: 60x35mm. Okno energetyczne 350-650 keV. Okno czasowe 16 ns.
Kaniulacja naczyń Kleszcze Dumonta	Roboz	RS-4991
PE-10 rurki polietylenowe	BD Intramedic	427401
Pompa infuzyjna	Braintree Scientific	BS-300
Sprzęt do monitorowania i bramkowania zwierząt	Small Animal Instruments Inc.	Model 1025	Używane tylko monitorowanie oddychania
Legowisko dla zwierząt z regulacją temperatury	(we własnym zakresie)

System System PET