Obrazowanie poklatkowe transfekowanych pierwotnych komórek kory mózgowej myszy

Streszczenie

Źródło: Landeira, BS, i wsp., Obrazowanie na żywo pierwotnych komórek kory mózgowej przy użyciu systemu hodowli 2D. J. Vis. Exp. (2017)

Film demonstruje zastosowanie obrazowania poklatkowego do śledzenia znakowanych fluorescencyjnie progenitorów kory mózgowej, monitorowania ich podziału i różnicowania oraz badania rozwoju linii w pierwotnych komórkach kory mózgowej

Protokół

1. Wideomikroskopia poklatkowa

UWAGA: Ten etap wymaga odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego z komorą inkubacyjną (patrz Tabela materiałów).

1. Po zakażeniu retrowirusem umieść płytkę do hodowli tkankowej w inkubatorze podłączonym do kontrolerów temperatury i CO₂.
   UWAGA: Wstępne podgrzanie komory przez 3 godziny przed rozpoczęciem obrazowania może pomóc zminimalizować dryft i rozogniskowanie podczas akwizycji.
   UWAGA: Komora powinna utrzymywać komórki w stałych warunkach 37 °C i 5% CO₂.
2. Wybierz pozycję na osi XY, która ma służyć jako punkt zerowy (XY = 0). Pozwoli to na ponowne odnalezienie stanowisk w przyszłości.
   UWAGA: Wskazane jest narysowanie na tabliczce znaku, który może służyć jako odniesienie do wyznaczenia punktu zerowego.
3. Wybierz pozycje, które mają być obrazowane przy 10-krotnym powiększeniu.
   UWAGA: Wybierz 10-15 pozycji na dołek, aby zwiększyć prawdopodobieństwo obserwacji komórek transfekowanych retrowirusowo.
   UWAGA: Długodystansowe obiektywy o dużym powiększeniu (20X lub 40X) mogą być używane do uzyskiwania obrazów o wyższej rozdzielczości. W zależności od odległości roboczej obiektywów mogą być wymagane płyty ze szklanym dnem.
4. Pobieraj obrazy kontrastu fazowego co 5 minut i obrazy fluorescencyjne co 3 godziny, aby zmniejszyć fototoksyczność. Sprawdź i dostosuj ostrość w ciągu pierwszych 3 godzin eksperymentu, ponieważ może się ona zmieniać, gdy temperatura się równoważy. Codziennie sprawdzaj i reguluj ostrość.
   UWAGA: Obserwujemy, że ostrość staje się stabilna po pierwszych 24 godzinach. Wskazane jest jednak monitorowanie ostrości. Alternatywnie możesz skorzystać z programowego systemu autofokusa.
5. Po 7 dniach przerwij pobieranie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
ImageJ	NIH
tTt	ETH Zurich
Mikroskop obserwatora komórek	Zeiss
Oprogramowanie do śledzenia (tTt)		https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html

{{}}