$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.
1. Barwienie fluorescencyjne żywych interneuronów
1. Przenieś plastry móżdżku za pomocą szklanej pipety Pasteura o szerokim otworze na płytkę 6-dołkową (maks. 3 plastry/na dołek). Zassać pożywkę ze zrównoważonym roztworem soli Hanksa (HBSS).
2. Inkubować plastry (maksymalnie 3 szt.) w 5 ml roztworu nasycającego barwnik fluorescencyjny (10 μM).
3. Aby chronić przed światłem, przykryj mikropłytkę folią aluminiową. Umieść go na ruchomym stole żyroskopowym z prędkością 35 obr./min na 10 minut przy temperaturze pokojowej, aby ułatwić etykietowanie komórek.
4. Przenieś plastry na membranę wkładki Transwell (wielkość porów 3,0 μm; Rysunek 1D) z szklaną pipetą Pasteura o szerokim otworze. Zassać pożywkę za pomocą pipety.
5. Wyjmij wkładkę i napełnij studzienkę 1,9 ml zmodyfikowanego podłoża orła (DMEM) firmy Dulbecco. Załóż wkładkę i dodaj 100 μl DMEM na wierzch plasterka, aby przykryć chusteczkę.
6. Umieścić płytkę zawierającą wkładki hodowlane w komorze inkubatora (37 °C, 5% CO2) na 2 godziny, co wystarcza do obserwacji komórek ziarnistych (GC) w warstwie molekularnej (ML). Połóż tkanki płasko, aby umożliwić przyczepienie do membrany wkładki (Rysunek 1E). Upewnij się, że plastry nie wysychają.
2. Ex vivo Obrazowanie za pomocą makroskopii konfokalnej
1. Przenieś płytkę bez plastikowej pokrywki do inkubatora przymocowanego do statywu makroskopu konfokalnego. Umieść szklaną osłonę na wkładce płytki makroskopu. Utrzymuj temperaturę komory na poziomie 37,0 °C ± 0,5 °C i dostarczaj plastry ze stałym przepływem gazu (95% O2, 5% CO2) przez wkładkę płytkową, aby utrzymać stałe pH. Odczekaj dodatkowe 2 godziny przed eksperymentem poklatkowym.
2. W celu zobrazowania migracji GC w wycinkach tkanki należy oświetlić preparat światłem o długości fali 488 nm za pomocą diody laserowej za pomocą konfokalnego makroskopu skaningowego laserowego wyposażonego w suchy obiektyw X2 (odległość robocza: 39 mm, średnica: 58 mm, NA = 0,234) i wykryć emisję fluorescencji od 500 do 530 nm.
1. Aby precyzyjnie rozdzielić ruch GC, pobierz obrazy z dodatkowym współczynnikiem zoomu optycznego od 1,5 do 2,0. Zbieraj obrazy GC w jednej płaszczyźnie ogniskowej lub do 10 różnych płaszczyzn ogniskowych wzdłuż osi z co 30 minut przez maksymalnie 12 godzin.
3. W razie potrzeby zdjąć szklaną pokrywę i dodać małe objętości (1-10 μl) aktywatorów biologicznych lub inhibitorów do DMEM za pomocą pipety 10 μl, aby zbadać ich wpływ na migrację GC.
3. Śledzenie komórek
1. Za każdym razem filmu wykonuj projekcję stosu z w trybie ecart-type w ImageJ. Moduluj poziomy kontrastu i jasności kolejnych obrazów, aby ułatwić identyfikację i śledzenie oznaczonych GC. Ręcznie zmapuj każdą pozycję na migawce referencyjnej (przy t = 0).
1. Użyj wtyczki "Ręczne śledzenie" w menu Analizuj cząstki i określ, klikając punkt ciężkości każdego ciała komórki podczas timelapse. Wyeksportuj nieprzetworzone dane śledzenia do arkusza kalkulacyjnego.
2. Zreorganizuj wyeksportowane surowe dane śledzenia z ImageJ za pomocą inteligentnego programu domowego, który identyfikuje każdą komórkę i powiązane pozycje. Za pomocą programu oblicz całkowitą przebytą odległość i średnią prędkość migracji dla każdej komórki. Klasyfikuj i porównuj charakterystyki migracji komórek w warunkach kontrolnych i leczniczych pod odpowiednimi filtrami przy użyciu tego samego programu.
