Obrazowanie poklatkowe podziału nerwowych komórek macierzystych myszy za pomocą mikroskopii konfokalnej

Streszczenie

Źródło: Daynac, M., et. al. Sortowanie komórek nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych ze strefy podkomorowej dorosłej myszy i obrazowanie na żywo ich dynamiki cyklu komórkowego. J. Vis. Exp. (2015)

Ten film demonstruje obrazowanie poklatkowe nerwowych komórek macierzystych (NSC) z mózgu transgenicznej myszy przy użyciu konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego. NSC fluoryzują na czerwono podczas fazy G1 i są niefluorescencyjne w innych fazach cyklu komórkowego. Przylegającą hodowlę NSC umieszcza się w komorze obrazowania, ustawia się parametry obrazowania, a obrazy są rejestrowane w regularnych odstępach czasu przez żądany czas.

Protokół

1. Podstawowa konfiguracja przed hodowlą i wideomikroskopią

1. Użyj płytek hodowlanych ze szklanym dnem lub płytek μ do konfokalnej mikroskopii wideo. Dla 1 - 5 x 10³ komórek/studzienki użyj płytek 96-dołkowych, a dla więcej niż 5 x 10³ komórek/studzienki użyj płytek 24-dołkowych.
2. Co najmniej jeden dzień przed rozpoczęciem eksperymentu należy przygotować sterylne płytki pokryte poli-D-lizyną (PDL) do przylegających kultur jednowarstwowych. Dodać wystarczającą ilość PDL (10 μg/ml w wodzie destylowanej lub dH₂O), aby pokryć dno każdej studzienki i inkubować przez noc (O/N) w temperaturze 37 °C. Usunąć roztwór PDL i spłukać trzykrotnie dH₂O przed pozostawieniem płytki do wyschnięcia w okapie przez co najmniej 2 godziny w przepływie laminarnym. Jeśli nie zostanie natychmiast zużyta, należy przechowywać powlekaną płytkę w temperaturze -20 °C.
3. Przygotować pożywkę hodowlaną, mieszając podłoże podstawowe neuronalnych komórek macierzystych (NSC) i suplement proliferacyjny NSC w stosunku 9:1 (patrz tabela materiałów) wraz z 2 μg/ml heparyny, 20 ng/ml oczyszczonego ludzkiego rekombinowanego naskórkowego czynnika wzrostu (EGF), i 10 ng/ml ludzkiego rekombinowanego czynnika wzrostu fibroblastów 2 (FGF-2). Przed użyciem podgrzać pożywkę do temperatury 37 °C w łaźni wodnej.
4. Do dysocjacji strefy podkomorowej (SVZ) należy przygotować roztwór papainy: 1 mg/ml papainy (15 UI/ml) w roztworze soli Earl's Balance (EBSS) zawierającym 0,2 mg/ml L-cysteiny, 0,2 mg/ml kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i 0,01 mg/ml DNazy I w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Wysterylizuj roztwór, przepuszczając go przez filtr 0,2 μm. Przed użyciem wyrównać roztwór w temperaturze 37 °C.
5. Aby zatrzymać reakcję enzymatyczną, należy przygotować roztwór inhibitora proteazy (Ovomucoid): zmodyfikowane podłoże eagle (DMEM) firmy dulbecco zawierające 0,7 mg/ml inhibitora trypsyny typu II. Przefiltrować roztwór za pomocą filtra 0,2 μm.
6. Przygotować 0,6% roztwór glukozy PBS do pobrania mózgów i 0,15% roztwór albuminy surowicy bydlęcej (BSA) PBS do etapów przemywania i barwienia przeciwciał.
7. Przygotuj narzędzia do preparowania: nożyczki, kleszcze do preparowania i wiązania oraz skalpel. Namocz je w 70% etanolu.

2. Pobieranie mózgów dorosłych myszy i mikrodysekcji SVZ

1. Ofiaruj dorosłe myszy ze wskaźnikiem ubikwitynacji fluorescencji (FUCCI) (w wieku od 2 do 3 miesięcy i/lub 12 miesięcy do badań starzenia), wykonując zwichnięcie szyjki macicy zgodnie z odpowiednimi wytycznymi instytucjonalnymi.
2. Spryskaj mysz 70% etanolem i odetnij głowę ostrymi nożyczkami.
3. Wykonaj nacięcie wzdłuż skóry głowy, aby odsłonić czaszkę.
4. Wykonaj podłużne cięcie linii środkowej, zaczynając od podstawy czaszki w kierunku opuszki węchowej za pomocą małych nożyczek. Upewnij się, że nie uszkodzisz leżącego pod spodem mózgu ostrzami nożyczek. Usuń górną otwartą część czaszki za pomocą zakrzywionych kleszczy, aby odsłonić mózg.
5. Zbierz mózg na 15-milimetrową szalkę Petriego zawierającą 0,6% glukozy w PBS.
6. Wypreparuj opuszki węchowe. Umieść mózg na jego grzbietowej powierzchni i wykonaj przekrój koronalny przez skrzyżowanie wzrokowe za pomocą skalpela.
7. Pod mikroskopem preparacyjnym umieść rostralną część części mózgu tak, aby przecięta powierzchnia koronowa była skierowana do góry w kierunku eksperymentatora.
8. Aby wypreparować SVZ, usuń przegrodę za pomocą cienkich zakrzywionych kleszczyków, a następnie włóż jedną końcówkę cienkich kleszczyków do prążkowia bezpośrednio przylegającego do komory i odłącz SVZ od otaczającej tkanki. Umieść rozcięty SVZ na szalce Petriego zawierającej 1 ml PBS-0,6% glukozy.

3. Dysocjacja tkanek SVZ

1. Zmiel rozcięty SVZ na szalce Petriego, aż nie pozostaną żadne duże kawałki.
2. Przenieść zmieloną tkankę wraz z PBS-0,6% glukozy do probówki o pojemności 15 ml i wirować przy 200 x g przez 5 minut.
3. Odrzucić supernatant i dodać 1 ml wstępnie podgrzanej papainy (1 mg/ml, przygotowanej w kroku 1.4) uzupełnionej 0,01 mg/ml DNazy I. Inkubować przez 10 minut w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C. Użyć 1 ml papainy na mysz.
4. Wirować przy 200 x g przez 5 minut i wyrzucić supernatant.
5. Dodać 1 ml wstępnie podgrzanego ovomucoidu (0,7 mg/ml, przygotowanego w kroku 1.5), aby zatrzymać aktywność papainy. Mechanicznie zdysocjuj zmieloną tkankę dalej w zawiesinę jednokomórkową, delikatnie pipetując 20 razy w górę i w dół przez końcówkę mikropipety p1000. Unikaj pęcherzyków powietrza.
6. Przepuść zawiesinę komórkową przez sterylny filtr 20 μm w nowej probówce o pojemności 15 ml. Pamiętaj, aby umyć filtr komórkowy PBS 0.15% BSA, aby uniknąć utraty komórek.
7. Wirować przy 200 x g przez 10 minut i odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl PBS zawierającego 0,15% BSA.

4. Barwienie immunofluorescencyjne do sortowania komórek

Do sortowania komórek przy użyciu myszy FUCCI-Red (Rysunek 1A), użyj następujących przeciwciał: CD24 koniugat fikoerytryny-cyjaniny7 [PC7]; CD15/LeX sprzężony z izotiocyjanianem fluoresceiny [FITC] i ligandem EGF sprzężonym z Ax647.

Uwaga: LeX⁺EGFR⁺ i komórki EGFR⁺ nie występują w obfitości u dorosłego SVZ: ≈ odpowiednio 600 i 1500 komórek/mysz. Zalecamy łączenie komórek SVZ od 2 do 3 myszy, aby mieć wystarczającą ilość materiału. Nie pracuj z więcej niż 12 myszami tego samego dnia, aby czas sortowania komórek nie przekraczał 3 godzin. Należy pamiętać, że praca ze zbyt dużą liczbą myszy tego samego dnia doprowadzi do wydłużenia czasu sortowania komórek, co może skutkować zwiększoną śmiercią komórek i/lub różnicowaniem komórek.

1. Wykonaj barwienie FACS w 100 μl PBS 0,15% BSA na mysz (lub w 200 μl dla grupy od 2 do 3 myszy w celu optymalnego barwienia).
2. Przygotować probówki kontrolne. Użyj koralików kompensacyjnych, aby przygotować pojedyncze rurki kontrolne koloru zgodnie z protokołem producenta. Wybierz frakcję komórek (wystarczy 1/10 komórek wyekstrahowanych od jednej myszy) i rozdziel ją na 4 probówki, aby przygotować 1 probówkę kontroli ujemnej (nieoznaczone komórki) i 3 probówki kontrolne fluorescencyjne minus jedna (FMO). Ponownie zawiesić komórki w 200 μl PBS 0,15% BSA na probówkę.
   Wskazówka: W przypadku kontroli LeX-FITC FMO, oznacz komórki CD24-PC7 (1:50) i ligandem EGF sprzężonym z Ax647 (1:200); w przypadku kontroli FMO CD24-PC7 oznacz komórki ligandem EGF sprzężonym z CD15 / LeX-FITC (1:50) i Ax647 (1:200), a w przypadku kontroli FMO liganda EGF sprzężonego z Ax647 oznacz komórki CD15 / LeX-FITC (1:50) i CD24-PC7 (1:50).
3. Do probówek używanych do sortowania komórek należy użyć następujących przeciwciał we wskazanym rozcieńczeniu w PBS 0,15% BSA: CD24-PC7 (1:50), CD15/LeX-FITC (1:50) i ligand EGF sprzężony z Ax647 (1:200).
4. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C w ciemności. Przemyć 1 ml PBS 0,15% BSA i odwirować przy 200 x g przez 10 min. Ponownie zawiesić komórki w 200 μl PBS 0,15% BSA na mózg. Trzymaj probówki do sortowania komórek na lodzie i natychmiast przystąp do sortowania komórek.
5. W przypadku korzystania z myszy FUCCI-Green, oddziel frakcje LeX-dodatnie i LeX-ujemne za pomocą kolumn separacyjnych przed sortowaniem komórek, ponieważ przeciwciało LeX-FITC ma tę samą długość fali emisyjnej, co zielona fluorescencja FUCCI (Figura 2A, B).
   1. Najpierw oznacz komórki mysim przeciwciałem anty-ludzkim LeX (1:50) przez 15 minut w temperaturze 4 °C w ciemności w 100 μl PBS 0,15% BSA.
   2. Przemyć komórki 1 ml PBS 0,15% BSA i odwirować przy 200 x g przez 10 minut, a następnie oznaczyć komórki mikrogranulkami anty-mysim IgM (1:10) przez 15 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
   3. Umyć komórki 1 ml PBS 0,15% BSA i odwirować przy 200 x g przez 10 min. Ponownie zawiesić ogniwa w 500 μl PBS 0,15% BSA i przelać komórki przez kolumnę separacyjną w polu magnetycznym, jak schematycznie pokazano na Rysunek 2C. Przemyć kolumnę 1 ml PBS 0,15% BSA w celu uzyskania frakcji ujemnej LeX.
   4. Aby uzyskać frakcję LeX-dodatnią, należy usunąć kolumnę separacyjną z pola magnetycznego i wymyć komórki za pomocą 2 ml PBS 0,15% BSA.
   5. Przejść do barwienia ligandów EGF sprzężonych z CD24-PC7 i Ax647, jak wskazano w 4.2.

5. Sortowanie komórek

Uwaga: Komórki zostały posortowane na sortowniku FACS przy 40 psi z dyszą 86 μm. Fluorescencję zebrano przy użyciu zestawu filtrów: 520/35nm (FITC), 575/26nm (PE), 670/20nm (Ax647) i 740LP (PC7). Kompensacja jest konieczna, aby zapobiec sygnałom fałszywie dodatnim, ponieważ widma emisyjne czerwonej fluorescencji FUCCI i barwnika PC7 nakładają się na siebie.

1. Bezpośrednio przed sortowaniem komórek dodaj niezbędny barwnik, aby odróżnić żywe komórki od martwych. Użyliśmy Hoechst (HO) (patrz tabela materiałów) w końcowym stężeniu 2 μg/ml. Przepuść probówkę kontroli ujemnej (nieoznaczone komórki) przez sorter FACS i wybierz komórki za pomocą parametrów rozpraszania bocznego (SSC) i rozpraszania do przodu (FSC) (Rysunek 3A).
   UWAGA: Martwe komórki zostały wykluczone przez bramkowanie tylko frakcji ujemnej HO (Rysunek 3A), a następnie dublety zostały wykluczone przez wybranie frakcji ujemnej szerokości impulsu (Rysunek 3A).
2. Uruchom pojedyncze kontrolki kolorów przygotowane w kroku 4.2 i w razie potrzeby dostosuj napięcia lampy fotopowielacza (PMT) (np. zbyt wysoka populacja ujemna i/lub dodatnie ogniwa poza skalą). Wykonaj kompensację kolorów w oknie kompensacji oprogramowania.
3. Uruchom kontrolki FMO przygotowane w kroku 4.2 (sterowanie LeX-FITC FMO, sterowanie FMO CD24-PC7 i sterowanie FMO liganda EGF sprzężonego z Ax647) i narysuj bramki sortujące (Rysunek 3). Posortuj komórki bezpośrednio do 100 μl pożywki hodowlanej w mikroprobówkach o pojemności 1,5 ml.

6. Przygotowanie komórek do mikroskopii

1. Płytkę świeżo posortowanych komórek o gęstości 1 - 3 x 10³ na 96-dołkowej płytce μ pokrytej poli-D-lizyną z 300 μl pożywki hodowlanej.
2. Przed mikroskopią wideo należy inkubować płytki hodowlane w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez co najmniej 1 godzinę, aby umożliwić adhezję komórek.

7. Konfiguracja mikroskopu i akwizycja obrazu

1. Wykonaj obrazowanie na żywo za pomocą obiektywu Plan Apo VC 20x DIC (NA: 0,75) na konfokalnym laserowym mikroskopie skaningowym podłączonym do odwróconej komory termostatycznej w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO₂.
2. Umieść 96-dołkową płytkę μ we wstępnie ogrzanej i zrównoważonej komorze termostatycznej i załóż pokrywę na termostatowaną pokrywę.
3. Otwórz oprogramowanie NIS-Elements i kliknij na pasku menu "Acquire/Acquisition controls/ND acquisition", aby wybrać opcje time-lapse (długość, pozycje stage, konfokalne przekroje z,...), "Acquire/Acquisition controls/Ti Pad", aby wybrać cele i "Acquire/Acquisition controls/A1plus Settings", aby wybrać poziom PMT dla każdej fluorescencji na pasku menu. Wybierz folder, w którym chcesz zapisać pliki danych.
4. Korzystając z okna akwizycji ND, ustaw środek każdej studzienki jako pozycję stolika i wybierz opcję dużego obrazu na 7 x 7 mm². Spowoduje to utworzenie mozaiki wokół środka każdej studni. Ustaw nakładanie się dużego obrazu mozaiki na 5%. Rób zdjęcia co 20 minut przez 24 godziny. Wybierz obiektyw Plan Apo VC 20x DIC (NA: 0.75) w oknie Ti Pad.
5. W oknie Ustawienia A1plus pobierz obrazy za pomocą szybkiego skanera rezonansowego w formacie 512 x 512 pikseli o rozdzielczości 1,26 μm/piksel. Użyj jasnego pola, aby zwizualizować kształty komórek. W przypadku myszy FUCCI-Red wzbudzić czerwoną fluorescencję przy 561 nm i zebrać za pomocą filtra 595/50 nm. W przypadku myszy FUCCI-Green wzbudzić zieloną fluorescencję przy 488 nm i zebrać za pomocą filtra 530/40 nm. Określ optymalny poziom PMT, przesunięcie i moc lasera dla każdej długości fali.
   UWAGA: Zalecamy korzystanie z funkcji autofokusa dla kanału jasnego pola, aby umożliwić oprogramowaniu automatyczne ustawianie ostrości w każdej pozycji stage przed każdym akwizycją. Wskazówka: Obiektyw Plan Apo VC 20x DIC (NA: 0,75) został użyty ze względu na doskonałą rozdzielczość bez konieczności stosowania oleju. W zależności od pożądanej rozdzielczości optycznej można zastosować inne obiektywy.
6. Wybierz przycisk "Uruchom teraz" w oknie akwizycji ND, aby rozpocząć pobieranie.

Wyniki

Rysunek 1: Analizy cyklu komórkowego na żywo przy użyciu myszy FUCCI-Red. (A) Schematyczne przedstawienie cyklu komórkowego FUCCI-Red, w którym komórki są czerwono-fluorescencyjne podczas G₁ faza i bezbarwna podczas faz S-G_2<...

Materiały