Mikroendoskopowe obrazowanie wapnia w czasie rzeczywistym u swobodnie poruszającej się myszy

Streszczenie

Źródło: Lee, H. et. al., Udane obrazowanie wapnia in vivo za pomocą zminiaturyzowanego mikroskopu montowanego na głowie w ciele migdałowatym swobodnie zachowującej się myszy. J. Vis. Exp. (2020)

Ten film pokazuje obrazowanie wapnia in vivo u myszy przy użyciu gradientowego współczynnika załamania światła lub soczewki GRIN i zminiaturyzowanego mikroskopu. Konfiguracja łączy mocowanie głowy w beztarciowym mobilnym systemie klatek, stymulując neurony i wyzwalając napływ jonów wapnia. Soczewka GRIN rejestruje sygnalizację wapnia w mózgu, umożliwiając wizualizację aktywności neuronów w czasie rzeczywistym.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

UWAGA: Protokół ten składa się z sześciu głównych etapów: operacji wstrzyknięcia wirusa, operacji implantu soczewki z gradientowym indeksem załamania światła (GRIN), walidacji implantacji soczewki GRIN, mocowania płytki podstawowej, optycznego zapisu sygnału GCaMP (fuzja białka zielonej fluorescencji (GFP), kalmoduliny (CaM) i M13, sekwencji peptydowej z kinazy łańcucha lekkiego miozyny) podczas testu zachowania oraz przetwarzania danych (ryc. 1A). Z wyjątkiem chirurgii stosowany jest komercyjny pakiet oprogramowania (Inscopix).

1. Chirurgia stereotaktyczna – wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem (AAV)
UWAGA: Szczep myszy używany w tej procedurze chirurgicznej to C57BL6/J. Ciało zwierzęcia podczas operacji przykrywa się sterylną zasłoną, a wszystkie czynności w protokole wykonywane są w sterylnych rękawiczkach. Wiele operacji zwykle nie jest wykonywanych tego samego dnia. Jeśli jednak wiele myszy musi przejść tę samą operację tego samego dnia, użyj oddzielnego zestawu autoklawowanych narzędzi chirurgicznych dla każdej myszy i 70% etanolu do dezynfekcji narzędzi chirurgicznych między myszami. Aby utrzymać mysz w cieple podczas zabiegu chirurgicznego, mysz po przymocowaniu do ramy stereotaktycznej przykrywa się wykonanym na zamówienie kocem chirurgicznym.

1. Zdezynfekuj wszystkie wymagane narzędzia chirurgiczne 70% etanolem i przygotuj strzykawkę Hamilton oraz szklaną pipetę. Napełnij szklaną pipetę wodą destylowaną.
   UWAGA: Wszystkie narzędzia chirurgiczne używane w protokole są sterylizowane w autoklawie. Ponieważ soczewki GRIN i śruby czaszki nie mogą być sterylizowane w autoklawie, 70% etanol jest stosowany jako środek dezynfekujący zapobiegający stanom zapalnym. Chociaż nie jest to próbowane, można zastosować inne formy sterylizacji, np. sterylizację gazową lub chemiczną.
2. Znieczulić mysz pentobarbitalem (83 mg∙kg-1 masy ciała) we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Gdy mysz straci przytomność, ogol futro na czaszce.
3. Oczyść skórę nad czaszką za pomocą 70% etanolu i przymocuj mysz do ramki stereotaktycznej. Ostrożnie usuń skórę i przetrzyj powierzchnię czaszki 35% roztworem nadtlenku wodoru za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką. Nałóż smarującą maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu rogówki podczas zabiegu.
   UWAGA: Chociaż zwykle nie ma problemu z użyciem 70% etanolu tylko do aseptycznego przygotowania skóry, zaleca się stosowanie 3 naprzemiennych rund środka dezynfekującego, np. jodoforu lub roztworu chlorheksydyny i 70% etanolu. W tym protokole stosuje się wyższe stężenie nadtlenku wodoru, aby upewnić się, że tkanka łączna na czaszce myszy zostanie usunięta tak całkowicie, jak to możliwe, co ma kluczowe znaczenie dla zmniejszenia artefaktów ruchu podczas późniejszego obrazowania, ponieważ tkanka łączna na czaszce zakłóca mocne przymocowanie płytki bazowej do czaszki. Należy zauważyć, że 35% nadtlenek wodoru jest znacznie wyższy niż normalnie stosowany (3%).
4. Zamocuj pin za pomocą uchwytu sondy stereotaktycznej. Wyrównaj wysokość bregmy i lambdy z kołkiem.
5. Znajdź konkretne miejsce na czaszce myszy do kraniotomii.
   UWAGA: Współrzędne bocznego ciała migdałowatego (LA) do wstrzyknięcia wirusa to (AP, ML, DV) = (-1,6 mm, -3,5 mm, -4,3 mm) od bregma w tym protokole (AP; Przednio-tylny, ML; Przyśrodkowo-Boczny, DV; Grzbietowo-brzuszny, każdy skrót wskazuje względną odległość osiową od bregmy). Współrzędne powinny być zoptymalizowane dla każdego warunku eksperymentalnego.
6. Wywierć powierzchnię czaszki (Rysunek 1B). Przemyć frakcje czaszki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Usuń pozostałą warstwę za pomocą kleszczy lub igły 27 G.
   1. Podczas wiercenia czaszki staraj się nie dotykać ostatniej warstwy opony twardej, aby uniknąć uszkodzenia powierzchni tkanki mózgowej. Uszkodzona powierzchnia mózgu powoduje stan zapalny wokół soczewki, który wywołuje poważne artefakty ruchowe i wysoką autofluorescencję podczas nagrywania. Kraniotomia wynosi 1,6 mm. Prędkość wiertła wynosi 18 000 obr./min, a rozmiar wiertła 0,6 mm.
7. Aby obniżyć soczewkę GRIN od powierzchni tkanki mózgowej w miejscu wiercenia do docelowego miejsca ciała migdałowatego, oblicz odległość nazwaną "Wartość A", odejmując różnicę DV między bregmą a odsłoniętą powierzchnią mózgu od współrzędnej DV implantacji soczewki, która jest ustawiana na podstawie bregmy (w tym przypadku 4,2 mm, Rysunek 1C).
8. Do szklanej pipety wsypać 3 μl oleju mineralnego i 0,7 μl roztworu wirusa AAV.
   UWAGA: Olej mineralny pomaga oddzielić roztwór wirusa od wody. 0,7 μl to objętość zoptymalizowana do wstrzyknięcia wirusa LA, która może w pełni pokryć LA.
9. Wyjmij szpilkę z uchwytu sondy stereotaktycznej i przymocuj do niej szklaną pipetę.
10. Umieścić szklaną pipetę w miejscu wstrzyknięcia wymienionym w kroku 1.5. Wprowadzić szklaną pipetę do tkanki mózgowej po całkowitym zatrzymaniu krwawienia.
11. Dostarczyć wirusa przez szklaną pipetę za pomocą pompy iniekcyjnej.
    UWAGA: Miano wirusa powinno być wyższe niż 1 x 1013 vg/ml, aby uzyskać wystarczającą liczbę komórek wykazujących ekspresję GCaMP. Prędkość wtrysku wynosi 0,1 μl/min i dyfuzji przez 10 min. Jeśli wystąpi krwawienie, przemyj powierzchnię mózgu PBS. Na tym etapie utrzymuj mokrą powierzchnię mózgu.
12. Po zakończeniu wstrzykiwania należy powoli wyjąć szklaną pipetę.

2. Chirurgia stereotaktyczna – implantacja soczewki GRIN
UWAGA: Operacja wszczepienia soczewki GRIN jest najważniejszym krokiem w tym protokole. Ponieważ stała, niska prędkość ruchu soczewki GRIN ma kluczowe znaczenie dla udanej implantacji soczewki GRIN, przydatne może być zmotoryzowane ramię chirurgiczne. Zmotoryzowane ramię chirurgiczne to manipulator stereotaktyczny, który jest sterowany przez oprogramowanie komputerowe. Chociaż w tym protokole używane jest ramię zmotoryzowane, można również zastosować inne sposoby, o ile soczewka porusza się konsekwentnie i powoli podczas implantacji. Szczegółowe informacje o urządzeniu znajdują się w Tabeli Materiałów.

1. Wywierć czaszkę, aby wszczepić dwie śruby czaszki. Umyj wszystkie frakcje czaszki za pomocą PBS.
   UWAGA: Aby zredukować artefakty ruchu w późniejszym obrazowaniu optycznym, wymagane są co najmniej dwie śruby. Dwie śruby czaszki i pozycja implantu soczewki GRIN tworzą trójkąt równoboczny (ryc. 1B). Rozmiar kraniotomii powinien ściśle przylegać do średnicy śruby. Jeśli wystąpi krwawienie, przemyj krwawiącą powierzchnię PBS. Prędkość wiertła wynosi 18 000 obr./min, a rozmiar wiertła 0,6 mm.
2. Zdezynfekuj śruby 70% etanolem, aby zapobiec stanom zapalnym. Wkręć śruby tak głęboko, jak to możliwe.
   UWAGA: Śruby powinny być mocno dokręcone bez dodatkowego przylegania, takiego jak cement.
3. Zamontuj zmotoryzowane ramię chirurgiczne na ramie stereotaktycznej. Podłącz wymagany sprzęt do laptopa, w którym zainstalowane jest oprogramowanie sterujące (tabela materiałów).
4. Przed opuszczeniem soczewki GRIN przygotuj się do wykonania ścieżki igły za pomocą igły 26 G.
   UWAGA: Ścieżka igły jest rodzajem ścieżki prowadzącej, która pomaga wszczepić stosunkowo grubą soczewkę GRIN do głębokich obszarów mózgu, takich jak ciało migdałowate, nie powodując poważnych zniekształceń struktury mózgu wzdłuż ścieżki wstrzyknięcia. Ta ścieżka prowadząca nazywana jest ścieżką igłową, ponieważ jest wytwarzana przez procedurę obniżania i podnoszenia stosunkowo cienkiej igły 26 G.
5. Zamocuj uchwyt kaniuli, aby stabilnie utrzymać igłę na ramie stereotaktycznej.
6. Chwycić igłę 26 G z uchwytem kaniuli i obliczyć współrzędne miejsca wprowadzenia igły.
   UWAGA: W tym protokole współrzędne miejsca wprowadzenia igły znajdują się w odległości 50 μm w bok od miejsca wstrzyknięcia wirusa (AP, ML, DV) = (-1,6 mm, -3,55 mm, -3,7 mm).
7. Uzyskaj dostęp do oprogramowania sterującego i pełne przygotowanie do manipulowania pozycją igły.
   1. Uruchom oprogramowanie sterujące i wybierz przycisk Rozpocznij nowy projekt, aby rozpocząć sesję kontrolną.
      UWAGA: W sesji kontrolnej znajduje się kilka pustych pól i przycisków menu. Puste pola są spacjami wejściowymi dla współrzędnych. Po wprowadzeniu współrzędnych w pustych polach zmotoryzowane ramię stereotaktyczne porusza się, klikając przycisk Idź do. Przycisk Go To zmienia się w przycisk STOP, gdy ramię stereotaktyczne jest w ruchu. Spośród kilku przycisków menu w tym protokole wymagany jest tylko przycisk Narzędzie.
   2. Kliknij przycisk Narzędzie. Skalibruj oprogramowanie sterujące, klikając przycisk menu Kalibruj ramkę. Kalibracja to proces, w którym rzeczywista pozycja manipulatora jest ustawiana jako wartości w oprogramowaniu Stereodrive.
8. Zlokalizuj końcówkę igły na odsłoniętej powierzchni mózgu na powierzchni czaszki za pomocą manipulatora stereotaktycznego.
   UWAGA: Prędkość igły ustawia się za pomocą menu prędkości Microdrive w menu Narzędzia. Domyślna prędkość to 3,0 mm/s. Jednak na tym etapie zalecana jest prędkość 0,5 mm/s. Ruch igły jest kontrolowany za pomocą klawiszy strzałek.
9. Dodaj 2-3 krople PBS, aby powierzchnia mózgu była mokra. Wypełnij puste pole na ekranie komputera odpowiednimi współrzędnymi DV LA. Jeśli powierzchnia mózgu jest sucha, utrudnia to penetrację igły w tkance mózgowej.
10. Opuścić wskazówkę 26 G, klikając przycisk Go To (Przejdź do). Zatrzymuje się automatycznie, gdy igła dotrze do miejsca docelowego ustawionego przez współrzędne DV. Prędkość igły wynosi 100 μm/min. Jeśli wystąpi krwawienie, zatrzymaj igłę, klikając przycisk STOP i umyj powierzchnię mózgu PBS. Na tym etapie utrzymuj mokrą powierzchnię mózgu. Po zatrzymaniu krwawienia ponownie zacznij obniżać.
11. Po całkowitym zatrzymaniu ruchu igły wprowadź 45,00 mm w pustym polu na ekranie komputera.
    UWAGA: 45,00 mm to wartość współrzędnej DV, która powoduje, że igła powraca do pozycji początkowej.
12. Podnieś igłę, klikając przycisk Idź do. Prędkość ruchu igły wynosi 100-200 μm/min.
13. Po tym, jak igła przestanie się poruszać, usuń PBS z powierzchni mózgu. Odinstaluj igłę i uchwyt kaniuli z ramy stereotaktycznej. Eksperymentator może ręcznie zatrzymać igłę, klikając przycisk STOP, gdy jest to konieczne.
14. Wyposaż pręt stereotaktyczny w uchwyt obiektywu. Zamontuj soczewkę GRIN w uchwycie obiektywu.
    UWAGA: W tym protokole używana jest soczewka GRIN zoptymalizowana pod kątem celowania w LA (0.6 mm średnicy, 7.3 mm długości). Jeśli uchwyt obiektywu nie jest przygotowany, alternatywnym sposobem jest użycie klipsa bulldog do uchwycenia soczewki GRIN.
15. Zdezynfekuj soczewkę 70% etanolem i przymocuj pręt stereotaktyczny do ramek stereotaktycznych.
16. Umieść końcówkę soczewki GRIN w wyznaczonym miejscu na powierzchni czaszki (ta sama metoda opisana w kroku 2.8).
    UWAGA: Współrzędna soczewki GRIN to (AP, ML, DV) = (-1.6 mm, -3.55 mm, -4.2 mm) (Rysunek 1C). Soczewka nie powinna dotykać czaszki, aby uniknąć uszkodzenia jej końcówki.
17. Oblicz współrzędną DV, odejmując wartość bezwzględną "Wartości A" od współrzędnej DV implantacji soczewki opisanej w kroku 2.16.
18. Upuść 2-3 krople PBS na powierzchnię mózgu. Wprowadź 1000 μm dla obniżenia i 300 μm dla podniesienia obiektywu w pustym polu na ekranie komputera.
19. Powtarzaj opuszczanie (1000 μm w dół) i podnoszenie (300 μm w górę) soczewki GRIN, aż dotrze do miejsca docelowego. Ta procedura podnoszenia i opuszczania ma na celu uwolnienie ciśnienia wytwarzanego wewnątrz tkanki mózgowej w wyniku procedury obniżania soczewki, która w przeciwnym razie może powodować zniekształcenia struktur mózgu wzdłuż ścieżki implantacji.
    UWAGA: Prędkość ruchu soczewki GRIN wynosi 100 μm/min. Nawet jeśli wystąpi krwawienie, nie przestawaj przesuwać soczewki GRIN i umyj powierzchnię mózgu PBS. Na tym etapie utrzymuj mokrą powierzchnię mózgu. Jeśli powierzchnia mózgu jest sucha, tkanka mózgowa przykleja się do powierzchni soczewki GRIN i powoduje zniekształcenie struktury mózgu.
20. Jeśli soczewka GRIN dotrze do miejsca docelowego, usuń PBS i ostrożnie nałóż żywiczny cement dentystyczny wokół soczewki GRIN, śrub i ich ścianki bocznej (Rysunek 1D).
    UWAGA: Nałożenie cementu żywicznego na całą czaszkę może zmniejszyć artefakty ruchu. Wręcz przeciwnie, jeśli cement żywiczny przypadkowo pokryje mięśnie przyczepione do czaszki, zwiększa artefakty ruchowe.
21. Po stwardnieniu żywicznego cementu dentystycznego zdemontuj soczewkę GRIN z uchwytu soczewki i nałóż cement akrylowy na całą czaszkę (ryc. 1D).
22. Aby przymocować płytę główną, zdemontuj uchwyt obiektywu z pręta stereotaktycznego i przymocuj płytę głowicy na końcówce pręta za pomocą taśm. Upewnij się, czy blacha czołowa jest pozioma.
    UWAGA: Pochylona blacha czołowa powoduje pochylenie view. Do zamocowania głowicy myszy w systemie klatek do domków mobilnych (w sekcji mocowania płyty podstawy) wymagana jest płyta główna. Jeśli eksperymentator nie korzysta z systemu, pomiń ten krok (krok 2.22) i następny krok 2.23.
23. Powoli opuść pręt, aż płyta głowicy znajdzie się w górnej części mankietu obiektywu. Obniż płytę głowicy o 1000 μm więcej. Przesuń płytę głowicy wszczepionej soczewki GRIN tak, aby znalazła się na prawej krawędzi wewnętrznego pierścienia płyty czołowej.
    UWAGA: Płyta głowicy powinna znajdować się niżej niż powierzchnia wszczepionej soczewki GRIN; w przeciwnym razie mikroendoskop nie może zbliżyć się wystarczająco blisko wszczepionej soczewki GRIN w celu regulacji płaszczyzny ogniskowej ze względu na cement akrylowy.
24. Nałożyć cement akrylowy, aby przymocować płytę głowicy do warstw cementu (rysunek 1D).
25. Przymocuj folię parafinową do wszczepionej powierzchni soczewki GRIN, aby chronić powierzchnię soczewki przed kurzem. Następnie nałóż usuwalne spoiwo epoksydowe na folię parafinową, aby utrzymać folię parafinową na powierzchni soczewki.
26. Wstrzyknąć karprofen, środek przeciwbólowy (0,5 mg/ml w PBS) i deksametazon, lek przeciwzapalny (0,02 mg/ml w PBS), roztwór do jamy otrzewnowej myszy.
    UWAGA: Dawka leku zależy od masy ciała: Karprofen (5 mg∙kg-1 masy ciała) i deksametazon (0,2 mg∙kg-1 masy ciała). Zarówno karprofen, jak i deksametazon podaje się po zabiegu chirurgicznym i raz dziennie przez 7 dni po zabiegu.
27. Wymieszaj 0,3 mg/ml amoksycyliny, antybiotyku, w wodzie w klatce domowej, aby podawać lek przez 1 tydzień.
28. Umieść mysz z powrotem w klatce domowej i odczekaj 5-8 tygodni na regenerację i transdukcję wirusa.
    UWAGA: Mysz jest odzyskiwana w ogrzanej klatce na kocu elektrycznym, dopóki mysz nie obudzi się ze znieczulenia.

3. Walidacja implantacji soczewki GRIN
UWAGA: Walidacja implantacji soczewki GRIN dostarcza informacji o tym, czy wszczepiona soczewka GRIN jest zgodna z komórkami wykazującymi ekspresję GCaMP. Opierając się na tych informacjach, eksperymentator oszczędza czas na czasochłonnych procesach, takich jak test behawioralny i przetwarzanie danych, wykluczając zwierzęta z niezamierzoną implantacją soczewek GRIN. Podczas procedury walidacji komórki z ekspresją GCaMP powinny być zogniskowane w polu widzenia zapisu. Na tym etapie używana jest klatka do domu mobilnego. Klatka do domku mobilnego to specjalistyczne urządzenie o okrągłym kształcie, które umożliwia myszom z mocowaną głową swobodne poruszanie nogami podczas walidacji implantacji soczewki GRIN i mocowania płytki bazowej. Stół do transportu powietrznego w tym aparacie, na którym umieszczone są nogi myszy z unieruchomioną głową, umożliwia taki swobodny ruch nóg, chociaż głowa jest nieruchoma. Komórki w jądrze bocznym ciała migdałowatego są zwykle ciche w stanie spoczynku lub znieczulenia, więc sygnały fluorescencyjne GCaMP są rzadko wykrywane w tych warunkach, co bardzo utrudnia, a czasem uniemożliwia, znalezienie komórek wyrażających GCaMP podczas walidacji implantacji soczewki GRIN i mocowania płytki bazowej. Jednak ruch nóg często wytwarza sygnały fluorescencyjne GCaMP w komórkach bocznego jądra ciała migdałowatego, a tym samym może pomóc w zlokalizowaniu mikroskopu. W związku z tym w tym protokole używana jest klatka domu mobilnego.

1. Zamontuj manipulator stereotaktyczny w systemie klatek w domu mobilnym.
2. Znieczulij mysz 1,5% gazem izofluranowym. Gdy mysz jest całkowicie nieprzytomna, umieść ją na pałąku pod głową systemu klatek do domków mobilnych.
3. Zlokalizuj klatkę węglową pod myszą. Zamknij klatkę węglową i włącz przepływ powietrza, aby klatka poruszała się swobodnie bez tarcia. Poczekaj kilka minut, aż mysz stanie się aktywna.
   UWAGA: Prędkość przepływu powietrza powinna być zoptymalizowana dla każdego warunku eksperymentalnego (tutaj 100 l/min).
4. Usuń film parafinowy i wiązanie epoksydowe z powierzchni wszczepionej soczewki GRIN i przetrzyj powierzchnię soczewki 70% etanolem za pomocą papieru do soczewek.
5. Przygotuj oprogramowanie do akwizycji danych (DAQ) (np. Inscopix). Ustaw warunki obrazowania.
   UWAGA: Oprogramowanie DAQ służy do sterowania mikroskopem (moc diody elektroluminescencyjnej (LED), ostrość obiektywu itp.) i przechowywania danych.
   1. Włącz skrzynkę DAQ i podłącz do niej mikroskop. Następnie podłącz go do laptopa bezpośrednio za pomocą kabla lub bezprzewodowego Internetu.
      UWAGA: Oprogramowanie DAQ jest instalowane w dodatkowym sprzęcie zwanym DAQ box (np. Inscopix). Podłączając skrzynkę DAQ do laptopa, oprogramowanie DAQ staje się dostępne w laptopie.
   2. Uzyskaj dostęp do oprogramowania DAQ za pomocą przeglądarki internetowej (zalecana jest przeglądarka Firefox).
   3. Ustaw wszystkie niezbędne szczegóły (datę, identyfikator myszy itp.) w zdefiniowanej sesji. Następnie kliknij Zapisz i kontynuuj. Po zapisaniu uzyskaj dostęp do sesji Uruchom.
   4. W sesji uruchamiania ustaw warunki obrazowania, takie jak czas ekspozycji, wzmocnienie, elektroniczne ustawianie ostrości i moc diody LED ekspozycji.
      UWAGA: Wzmocnienie i moc diody LED ekspozycji mogą się zmieniać w zależności od warunków laboratoryjnych. Zalecana wartość dla ostrości elektrycznej to 500, a czas ekspozycji to 50 ms. Nie ma ograniczeń dotyczących zmiany mocy i wzmocnienia diody LED. Jednak większe natężenie światła może powodować większe wybielanie. Czas naświetlania nagrywania określa liczbę klatek na sekundę podczas nagrywania wideo. Wyższa liczba klatek na sekundę zmniejszy intensywność sygnału. Liczba klatek na sekundę powinna być zoptymalizowana pod kątem GECI używanych do obrazowania.
6. Aby utrzymać mikroskop na manipulatorze stereotaktycznym, przymocuj pręt stereotaktyczny z chwytakiem mikroskopu do manipulatora stereotaktycznego.
   UWAGA: Chwytak jest małym akcesorium, które można przymocować do aparatu stereotaktycznego w celu przytrzymania korpusu mikroskopu w celu umieszczenia go w docelowym miejscu mózgu.
7. Chwyć mikroskop za pomocą chwytaka mikroskopu. Włącz diodę LED podłączoną do mikroskopu i ustaw mikroskop w pionie. Opuść mikroskop podczas obserwacji obrazu, aż pojawi się powierzchnia wszczepionej soczewki GRIN.
8. Wyrównaj środek wszczepionej soczewki GRIN ze środkiem view.
   UWAGA: Walidację implantacji soczewki GRIN można przeprowadzić na tym etapie (wspomniano w sekcji wyników, Rysunek 2B, Rysunek 2D, Rysunek 2F).
9. Przechwyć obraz wszczepionej powierzchni soczewki GRIN (kliknij przycisk Prt Sc na klawiaturze). Obraz powierzchni wszczepionej soczewki GRIN jest wymagany do odznaczenia komponentów nieneuronalnych podczas późniejszego przetwarzania danych (krok 6.8).
10. Znajdź odpowiednią pozycję mikroskopu. Powoli podnieś soczewkę obiektywu mikroskopu podczas obserwacji obrazu, aby wyszukać komórki z ekspresją GCaMP7b.
    UWAGA: Może być konieczne dostosowanie wzmocnienia akwizycji obrazu lub mocy diody LED ekspozycji. Walidacja implantacji soczewki GRIN może być przeprowadzona na tym etapie (wspomniana w sekcji wyników, Rysunek 2A, Rysunek 2C, Rysunek 2E).

Wyniki

Rycina 1: Schematyczny przebieg pracy i schematy chirurgii stereotaktycznej do mikroendoskopowego obrazowania wapnia in vivo w Los Angeles. (A) Schematyczny przebieg mikroendoskopowego obrazowania wapnia in vivo w Los Angeles. (B) Mikroskopowy obraz prze...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Igła 26G	BD	302002	Chirurgia
AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE	Addgene	104493-AAV1	Chirurgia
AAV2/1-CaMKiiα-GFP	Chirurgia
na zamówienieCement akrylowo-dentystyczny (Ortho-jet Acrylic Pink)	Lang	1334-pink	Chirurgia i mocowanie płytki bazowej
Manipulator przepływu powietrza	Neurotar	NTR000253-04	Nasadka do płytki bazowej
Amoksycylina	SIGMA	A8523-5G	Chirurgia
Klatka węglowa	Neurotar	180mm x 70mm	Nasadka do płyty bazowej
Carprofen	SIGMA	PHR1452-1G	chirurgia
Oprogramowanie do przetwarzania danych	INSCOPIX	Oprogramowanie do przetwarzania danych INSCOPIX	Test mocowania i zachowania płytki bazowej
Deksametazon	SIGMA	D1756-500MG	Wiertło chirurgiczne
	Seyang	marathon-4	Wiertło chirurgiczne
	ELA	US1/2, Shank104	Chirurgia
Szklana igła	WPI	PG10165-4	Chirurgia
Soczewka GRIN (sonda soczewkowa INSCOPIX Proview)	INSCOPIX	1050-002208	Chirurgia
Strzykawka	Hamilton	84875	Chirurgia
Płyta główna	Neurotar	Model 5	Chirurgia
Laptop	Samsung	NT950XBV	Surgery
Uchwyt na soczewki, pręt stereotaktyczny (zestaw implantów INSCOPIX proview)	INSCOPIX	1050-004223
Chirurgia Chwytak mikroskopu	INSCOPIX	1050-002199	Przystawka do płytki bazowej
Mikroskop, oprogramowanie DAQ, sprzęt	INSCOPIX	nVista 3.0	Mocowanie płytki bazowej i test zachowania
Mobilna klatka domowa	Neurotar	MHC V5	Mocowanie płytki bazowej
Zmodyfikowane ramię	Neurostar		Dostosowane oprogramowanie do chirurgii
Moterized	Neurostar	Indywidualna	chirurgia
Zdejmowane spoiwo epoksydowe	WPI	Kwik-Cast	Surgery
Cement żywiczny (Super-bond)	Sun medical	Super bond C&B	Surgery
Śruba czaszki	Stoelting	51457	Surgery
Rama stereotaktyczna	Stoelting	51600	Surgery
Manipulator	stereotaktycznyStoelting	51600	Mocowanie płyty bazowej