Artykuł metodologiczny

Izolacja & Charakterystyka barwnika Hoechstniski CD45ujemny Mezenchymalne komórki macierzyste płuc myszy

23.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3159

⸱

26 października 2011

 ,  ,  ,  , 
1Charles C. Gates Regenerative Medicine and Stem Cell Biology Program, University of Colorado Denver, 2Department of Medicine, University of Colorado Denver, 3Cancer Center, University of Colorado Denver, 4Webb Waring Institute, University of Colorado Denver

W tym artykule

Podsumowanie

W niniejszym artykule prezentujemy izolację mysich rezydentnych mezenchymalnych komórek macierzystych płuc (lung MSC), ich ekspansję, charakterystykę oraz analizę właściwości immunomodulacyjnych.

Streszczenie

Mezchymalne komórki macierzyste (MSC) rezydujące w tkankach są istotnymi regulatorami naprawy lub regeneracji tkanek, włóknienia, stanu zapalnego, angiogenezy oraz tworzenia się guzów. Wspólnie badania te sugerują, że rezydujące w płucach MSC odgrywają rolę w homeostazie tkanki płucnej, w procesach uszkodzenia i naprawy podczas przebiegu takich chorób jak włóknienie płuc (PF) i nadciśnienie tętnicze płucne (PAH). W niniejszej pracy opisujemy technologię służącą do zdefiniowania populacji rezydujących w płucach MSC. Definiowanie tej populacji in vivo w tkance płucnej przy użyciu określonego zestawu markerów ułatwia powtarzalną izolację dobrze scharakteryzowanej populacji komórek macierzystych za pomocą cytometrii przepływowej oraz badanie specyficznego typu i funkcji komórkowej.

Protokół

1. Izolacja płuc

  1. Uśmierć dorosłe myszy (wiek 8-10 tygodni; masa 18-20 g; szczep C57Bl6J) poprzez podanie przedawkowanej dawki izofluranu, a następnie przeprowadź upuszczenie krwi, stosując technikę sterylną. Profile mogą się nieznacznie różnić w zależności od szczepu.
  2. Chirurgicznie usuń przeponę, otwórz jamę klatki piersiowej, przecinając klatkę żebrową bocznie po każdej stronie ciała myszy. Wypłucz krew z płuc, delikatnie perfundując prawą komorę serca przy użyciu 3-5 ml soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS).
  3. Wypreparuj płaty płuc, usuwając tchawicę i główne oskrzela, a następnie umieść je w szalce Petriego wypełnionej zbuforowanym roztworem soli Hanksa (HBSS). Po zebraniu wszystkich płatów płuc, za pomocą pęsety przenieś tkankę na pokrywkę szalki. Następnie posiekaj tkankę na małe kawałki za pomocą jednorazowych skalpeli, dodając tyle cieczy, aby utrzymać je w wilgoci, ale nie na tyle dużo, aby kawałki unosiły się i przemieszczały.
  4. Wypreparuj kończynę tylną jednej z myszy i wyizoluj szpik kostny, aby użyć go jako kontroli barwienia do ustawienia bramkowania w cytometrii przepływowej. Zabarw szpik kostny (BM) zgodnie z wcześniej opisaną procedurą 1.

2. Przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek z tkanki płucnej

  1. Każde płuco poddaje się trawieniu, stosując zoptymalizowany stosunek masy tkanki do objętości wynoszący 0,2g: 5mls podgrzanego do 37°C 0,2% kolagenazy typu 2 Worthington (Worthington Biochemicals, Lakewood, NJ; cat # LS004202) rozpuszczonej w sterylnym HBSS. Mieszaninę zanurza się w łaźni wodnej o temperaturze 37°C na 30 min 2,3.
  2. Próbkę należy dokładnie triturować, aż trawiona tkanka płucna będzie swobodnie przepływać przez pipetę 10ml (około 10 powtórzeń). Inkubować przez dodatkowe 15 min w temperaturze 37°C, aby dokończyć trawienie tkanki i zapewnić bardziej jednorodną zawiesinę pojedynczych komórek.
  3. Zawiesinę komórek płuc rozcieńczyć HBSS i triturować pipetą 5ml, aby rozproszyć pozostałe fragmenty tkanki.
  4. Zawiesinę przefiltrować przez sitko komórkowe 70μM, aby usunąć nietrawione fragmenty tkanki. Na tym etapie próbkę można rozdzielić do kilku probówek stożkowych, aby zapobiec przeciążeniu jednego sitka komórkowego i skrócić czas procesu.
  5. Zawiesinę komórkową wirować przez 10 min przy 1500 rpm, a następnie odlać nadsącz.
  6. Osad komórkowy delikatnie resuspendować w buforze do lizy RBC w temperaturze pokojowej (eBiosciences, San Diego, CA; cat # 00-4333-57) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min. Dodać równą objętość HBSS, aby dezaktywować bufor do lizy, a następnie przefiltrować zawiesinę komórkową przez sitko komórkowe 40μM w celu usunięcia zanieczyszczeń i agregatów komórkowych.
  7. Odpipetować 10μl każdej próbki przeznaczonej do barwienia i policzyć liczbę komórek dla próbek płuc i szpiku kostnego (BM) za pomocą hemocytometru. Uwaga: należy zapisać całkowitą objętość zawiesiny komórek.
  8. Zawiesinę pojedynczych komórek płuc sfałdować przez wirowanie przy 1500 rpm przez 10 min.
  9. Resuspendować komórki płuc i szpiku kostnego do stężenia 1x106 komórek/ml w podgrzanym (37°C) DMEM+ (Dulbecco's modified Eagle's medium, high glucose (Gibco, Carlsbad, CA; cat # 11965-092) zawierającym 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 10mM HEPES.
  10. Przygotować roztwór zapasowy barwnika Hoechst 33342 o stężeniu 1mg/ml (Sigma Chemical Company, St.Louis, MO; cat # B2261) w wodzie i poddać sterylizacji filtracyjnej 1,4. Barwnik Hoechst można przechowywać w formie alikwotów w temperaturze -80°C.
  11. Do zawiesiny pojedynczych komórek dodać barwnik Hoechst 33342 do stężenia końcowego 5μg/ml (rozcieńczenie 200x roztworu zapasowego 1mg/ml).
  12. Komórki wymieszać poprzez delikatne odwracanie probówki i inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37°C przez dokładnie 90 minut.

3. Barwienie i przygotowanie zawiesiny komórek płuc do analizy cytometrii przepływowej

  1. Po 90 min wszystkie etapy z komórkami płuc barwionymi Hoechstem muszą być przeprowadzane w temperaturze 4°C lub na lodzie, aby zapobiec wypływowi barwnika. Osadź komórki poprzez wirowanie przy 1500 rpm przez 10 min w 4°C i resuspenduj je w lodowatym buforze do barwienia (PBS+2%FBS).
  2. Resuspenduj komórki do stężenia nieprzekraczającego 1x107 komórek/probówkę, używając 300-600μl PBS zawierającego 2% FBS i 10mM HEPES.
  3. Do próbek płuc i szpiku kostnego (BM) dodaj odpowiednio miareczkowane przeciwciało CD45 (zazwyczaj rozcieńczenie 1:200 CD45-APC (BD Pharmingen, San Diego, CA; kat. nr 559864). Inkubuj na lodzie przez 10-15 min. Uwzględnienie niebarwionej kontroli podczas procedury eksperymentalnej jest przydatne do ustawienia bram analizy.
  4. Osadź komórki w 4°C przez 5 min przy 1500 rpm. Odlej nadsącz i resuspenduj komórki w 500 μl schłodzonego buforu do barwienia (PBS+2%FBS). Przenieś je do schłodzonych polipropylenowych probówek z zakrętką typu snap cap (Fisherbrand, Schaumburg, IL; kat. nr 14-956-1D).
  5. Do próbek dodaj jodek propidyny (PI, stężenie zapasu 200μg/ml w PBS) do uzyskania stężenia końcowego 2μg/ml, aby wykluczyć martwe komórki. PI należy stosować w połączeniu z barwnikiem Hoechst 33342, aby uzyskać prawidłowy profil fluorescencji podczas analizy cytometrycznej.
  6. Przechowuj probówki na lodzie, chroniąc je przed światłem do czasu analizy cytometrycznej.

4. Analiza cytometryczna w celu zdefiniowania i wyizolowania populacji mezenchymalnych komórek macierzystych płuc (lung MSC) z wykorzystaniem wypływu barwnika Hoechst do detekcji populacji bocznej (SP)

  1. Analiza ta wymaga następujących instrumentów:
    • lasery 488 nm i UV (350–355 nm)
    • 2 detektory na drodze wiązki lasera UV z filtrami niebieskim (450/65) i czerwonym (675/50).
    • Detektor UV-czerwony musi charakteryzować się wysoką czułością na sygnał czerwony. Może to stanowić problem w przypadku starszych sorterów komórek.
    • Chłodziarka do utrzymania próbki w temperaturze 5-10°C.
  2. Zjustować lasery i przygotować urządzenie do sortowania komórek zgodnie z protokołem producenta.
  3. Należy zebrać sygnały Hoechst w kanale czerwonym (oś x) i niebieskim (oś y), korzystając ze skali liniowej.
  4. Należy dostosować napięcia lamp fotopowielaczy tak, aby peak G0/G1 znajdował się w górnej prawej części środka wykresu, co umożliwi odpowiednie wyświetlenie populacji krawędzi opadającej. Część fazy S oraz cała faza G2 cyklu komórkowego mogą znajdować się poza skalą w górnym prawym rogu wykresu. Sygnał niebieski jest stosunkowo jasny, natomiast sygnał czerwony jest słaby. Typowe napięcia dla urządzenia MoFlo XDP (Beckman Coulter, Miami, FL) wynoszą 425 dla kanału niebieskiego i 650 dla kanału czerwonego.
  5. Martwe komórki są odrzucane (wykluczane z analizy) poprzez bramkowanie za pomocą PI. Można zastosować standardową ścieżkę detekcji PI (wzbudzenie 488 nm, emisja 630 nm). Alternatywnie PI jest wzbudzane przez laser UV, a populacja martwych komórek znajduje się poza skalą, po prawej stronie wykresu populacji bocznej (SP). Eliminuje to konieczność kompensacji sygnału PI względem innych fluorochromów, takich jak FITC i PE. Pierwotna metoda Goodella opierała się na tej drugiej procedurze. 5-7.
  6. Podczas analizy i sortowania należy utrzymywać stosunkowo niską różnicę ciśnień, aby zapewnić wysoką rozdzielczość populacji bocznej (side population).
  7. SP przejawia się jako boczna odgałęzienie oddzielone od głównej populacji komórek płuc. Populację tę określa się mianem Hoechstniski.
  8. Barwnik HoechstniskiPróbkę /SP analizuje się w celu oddzielenia populacji CD45-dodatnich i CD45-ujemnych przy użyciu histogramu 2,3 (Rycina 1).
  9. Po selekcji i bramkowaniu sygnału HoechstniskiCD45negatywny populacja MSC płuc: komórki można zebrać poprzez sortowanie w postaci populacji mieszanej do probówki lub pojedynczych komórek w celu izolacji klonów do płytki 96-dołkowej 3.
  10. W przypadku sortowania do płytek odchylenie strumienia sortowania ustawia się na 25%, aby uzyskać bardziej pionowy strumień sortowania niż ten zazwyczaj stosowany przy sortowaniu do probówek.
  11. Skalibruj kierunek strumienia sortującego, wysyłając impuls testowy do studni w lewym górnym, a następnie w prawym dolnym rogu płytki 96-dołkowej.
  12. Skonfiguruj mapę płytek w oprogramowaniu sortera w taki sposób, aby do każdej dołki naniesiono pożądaną liczbę komórek.
  13. Aby wyizolować klony pojedynczych komórek, pojedynczą MSC z płuc sortuje się do dołka płytki 96-dołkowej zawierającej 150μl pożywek hodowlanych (α-MEM uzupełniony o 20% FBS). Po sortowaniu dodatkowe 100μl dodaje się pożywki.

5. Izolacja, hodowla i charakterystyka MSC płuc oraz ich klonów

  1. Kultywowanie i ekspansja mieszanej populacji MSC płuc oraz klonów pojedynczych komórek po sortowaniu odbywają się w identyczny sposób przy zastosowaniu standardowych warunków hodowli (37°C, 5% CO2 i >95% wilgotności). Po izolacji komórki pozostawia się na 16 godzin w celu umożliwienia adhezji. Pożywkę wymienia się co 48 godzin (α-MEM uzupełniony o 20% FBS). Gdy komórki zaczynają szybciej proliferować i osiągają od 75-80% konfluencji, wykonuje się pasaż (Rysunek 2).
  2. Komórki płucze się uprzednio ogrzanym HBSS i inkubuje z 0,5% trypsyną/EDTA (Cellgro, Manassas, VA; kat. nr 25-053-Cl) w temperaturze 37°C przez mniej niż 2 min. Komórki monitoruje się za pomocą mikroskopu odwróconego, aby potwierdzić powstanie zawiesiny komórkowej.
  3. MSC płuc są następnie dzielone w stosunku 1:2 lub 1:3, w zależności od aktualnego tempa proliferacji hodowli.
  4. Dla każdej preparacji komórkowej ocenia się zdolność MSC płuc do różnicowania się w tradycyjne linie mezenchymalne osteoblastów, adipocytów i chondrocytów oraz ich powierzchniową ekspresję uznanych markerów mezenchymalnych. Wykonuje się również analizę prążkowania cytogenetycznego w celu potwierdzenia braku poważnych aberracji chromosomalnych 2,3,8-11.

6. Liczenie MSC płuc z wykorzystaniem testu tworzenia kolonii (CFU-F)

  1. Rozcieńczyć komórki w pożywce Complete MesenCult (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC) do końcowego stężenia 1x106 komórek/ml.
  2. Wyonać rozcieńczenia szeregowe, aby uzyskać w szalce 100mm końcowe liczby komórek wynoszące 6x104 komórek, 3x104 komórek, 1,5 x104 komórek oraz 0,75 x104 komórek w 10ml pożywki. Analizy przeprowadza się w duplikacie lub triplikacie dla każdego stężenia komórek; można je przeskalować dla mniejszych powierzchni.
  3. Kulturować komórki przez 10 dni w standardowych warunkach. W 10. dniu komórki przepłukać PBS i utrwalić za pomocą 100% metanolu przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Wykryć kolonie CFU-F poprzez barwienie 0,4% w/v roztworem barwiącym Giemsy (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) rozcieńczonym 1:20 wodą dejonizowaną. Pozostawić próbki do wyschnięcia na powietrzu i określić liczbę kolonii zawierających więcej niż 25 komórek na kolonię (Rycina 3).

7. Analiza właściwości immunomodulacyjnych MSC z płuc w odniesieniu do proliferacji i apoptozy limfocytów T

  1. 6,25x104 komórek MSC z płuc wysiewa się do płytek 96-dołkowych i pozostawia na noc 2.
  2. Komórki CD4+ ze śledzion śledziony myszy transgenicznych z receptorem limfocytów T (TCR), linii OT-II z limfocytami T rozpoznającymi peptyd owalbuminy 323-339, są oczyszczane poprzez usuwanie komórek CD8+, CD19+, MHC-II+ oraz CD25+ przy użyciu sortera komórek Miltenyi AutoMACS (Miltenyi, Auburn, CA). Komórki prezentujące antygen (APC) są izolowane poprzez pozytywną selekcję komórek MHC-II+ 12.
  3. Komórki APC utrwala się w 4% paraformaldehydzie, przemywa 3 razy w PBS/5% BSA/2mM EDTA i obciąża 0,5μg/ml lub 5μg/ml peptydu OVA323.
  4. Symulowane, zablokowane w fazie wzrostu APC dodaje się do komórek MSC z płuc w płytkach 96-dołkowych.
  5. Oczyszczone w ponad 95% komórki CD4+ w ilości 1x105 znakuje się 5μM karboksyfluoresceiny z estrem sukcynimidylowym (CFSE; Sigma, St.Louis MO) w PBS, inkubuje przez 5 min w ciemności, przemywa PBS-5% BSA, a następnie dodaje do komórek APC i MSC z płuc w pożywce DMEM 5% FBS. Komórki inkubuje się następnie przez 96 godzin.
  6. Limfocyty T barwi się następnie przeciwciałami anty-CD40 (Cy5), CD4 (APC-Cy7), CD8 (ViolBlue), Vbeta 5 (PE) i analizuje przy użyciu 7-kanałowego cytometru przepływowego Miltenyi MacsQuant (Miltenyi, Aurburn, CA) oraz oprogramowania analitycznego FloJo (Treestar, Ashland, OR). Proliferację mierzy się jako spadek średniej intensywności fluorescencji CFSE w porównaniu do tła, czyli limfocytów T znakowanych CFSE i nieeksponowanych na APC (Rycina 4). W tym czasie zlicza się limfocyty T i ocenia ich żywotność metodą wykluczenia błękitu trypanu.

8. Reprezentatywne wyniki:

Wykresy analizy cytometrii przepływowej ilustrujące różnicowanie populacji komórek i poziomy ekspresji CD45.
Rycina 1. Analiza cytometryczna i definicja MSC płuc. Pojedyncze zawiesiny komórek z digestu tkanki płucnej są barwione Hoechst 33342 i analizowane metodą cytometrii przepływowej w celu wykrycia różnic w A. rozproszeniu przednim (FSC) i bocznym (SSC) oraz B. fluorescencji niebieskiej i czerwonej Hoechst. Obecność populacji bocznej (SP) jest widoczna w bramce. Następnie analizowana jest populacja SP Hoechstlow w celu wyodrębnienia C. populacji CD45negatywnej MSC płuc. Stosunki populacji CD45 dodatniej do negatywnej w SP płuc wynoszą zazwyczaj 70:30 / 60:40.

Porównanie hodowli komórkowych na obrazie mikroskopowym; A: odizolowane komórki, B: tworzenie sieci fibroblastów.
Rycina 2. Izolacja i hodowla MSC z płuc. Po zebraniu MSC z płuc metodą sortowania komórek, komórki wysiewa się do szalek 30 mm w pożywce α-MEM uzupełnionej o 20% FBS. A. Świeżo posortowane komórki są małe, okrągłe i jasne. B. Po około 2-3 tygodniach pojawiają się kolonie o fenotypie mezenchymalnym, a proliferacja staje się bardziej wyraźna.

Analiza hodowli komórkowych; obrazy mikroskopowe; szalka Petriego, wzrost kolonii komórek, paski skali do pomiaru.
Rysunek 3. Wyznaczanie liczby MSC za pomocą testu CFU-F (zdolności do tworzenia kolonii fibroblastycznych). Namnożone MSC z płuc zostają wysiane zgodnie z opisanym protokołem testu CFU-F. A. Po 10 dniach i barwieniu metodą Giemsy widoczne są kolonie. B. Kolonie są duże i składają się z kilkuset komórek. C. Komórki wykazują fenotyp mezenchymalny. A i B, Pasek skali = 0.5 cm; C Pasek skali = 0.14 cm.

Analiza cytometrii przepływowej, wykres kropkowy, limfocyty T, APC, wpływ MSC z płuc, schemat ekspresji CFSE vs CD40.
Rysunek 4. Test proliferacji limfocytów T oparty na CFSE. Wobec braku MSC z płuc i w obecności komórek prezentujących antygen (APC) +/- owalbuminy (OVA), CD40dodatnie efektorowe limfocyty T wykazują spadek intensywności CFSE, co wskazuje na proliferację (czerwone koło). Intensywność fluorescencji CFSE w błonie limfocytów T maleje stechiometrycznie przy każdym podziale komórki, tj. z każdym podziałem. W obecności MSC z płuc, APC +/- OVA, CD40dodatnie efektorowe limfocyty T nie wykazują istotnych zmian w intensywności CFSE, co wskazuje na brak proliferacji (czerwone koło).

Dyskusja

Zaadaptowaliśmy metodę początkowo stosowaną do identyfikacji komórek krwiotwórczych szpiku kostnego (BM), aby wyizolować specyficzną populację rezydentnych MSC płuc. Dzięki powtarzalności izolacji, komórki te zostały następnie dokładnie scharakteryzowane jako MSC. Ich pochodzenie zdefiniowano jako rezydentne w płucach dorosłej myszy (w przeciwieństwie do pochodzenia z BM), a ich profil fenotypowy i molekularny został udokumentowany 2. Zdolność do wielokrotnej izolacji tej scharakteryzowanej populacji umożliwia dalsze badanie biologicznego znaczenia i roli MSC płuc podczas homeostazy tkankowej oraz w przebiegu chorób. Niedawne zdefiniowanie tej populacji in vivo zarówno w tkance płucnej mysiej, jak i ludzkiej, ułatwia opracowanie strategii terapeutycznej ukierunkowanej na aktywację endogennych komórek w celu wspierania regeneracji płuc podczas urazów i chorób.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca ta była finansowana z grantów przyznanych SMM: AHA GIA0855953G, NIH 1R01 HL091105-01. Dodatkowe wsparcie zapewnili: DW: NIH RO1DK075013, DDK oraz Fundacja Kleberg; UCCC Flow Cytometry Core (NIH 5 P30 CA 46934-15), UCCC Microarray core (NCI P30 CA 46934-14).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bufor fosforanowo-solny (PBS)Sigma-AldrichP-5368
zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS)Thermo Fisher Scientific, Inc.SH30588.01
0,2% kolagenaza Worthington typu 2Worthington BiochemicalLS004202
Bufor do lizy erytrocytóweBioscience00-4333-57
DMEMInvitrogen11965-092
H–barwnik chst 33342Sigma-AldrichB2261
CD45-APCBD Biosciences559864
Jodek propidiumSigma-Aldrich81845
a-MEMThermo Fisher Scientific, Inc.SH30265.01
FBS (płodowa surowica bydlęca)Invitrogen16000-069
0,5% trypsyny/EDTACellgro25-053-Cl
Pełna pożywka MesenCultTechnologie komórek macierzystych05511
0,4% w/v roztwór barwiący GiemsySigma-AldrichGS1L
4% paraformaldehydElectron Microscopy Sciences1571016% paraformaldehyd rozcieńczono do stężenia 4% przy użyciu buforu PBS
Karboksyfluoresceina z estrem sukcynimidylowym (CFSE)Sigma-Aldrich21888

Bibliografia

  1. Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).
  2. Jun, D. H. The Pathology of Bleomycin Induced Fibrosis is Associated with Loss of Resident Lung Mesenchymal Stem Cells Which Regulate Effector T-Cell Proliferation. STEM CELLS. , (2011).
  3. Martin, J. Adult lung side population cells have mesenchymal stem cell potential. Cytotherapy. 10, 140-151 (2008).
  4. Majka, S. M. Distinct progenitor populations in skeletal muscle are bone marrow derived and exhibit different cell fates during vascular regeneration. The Journal of Clinical Investigation. 111, 71-79 (2003).
  5. Goodell, M. A., McKinney-Freeman, S., Camargo, F. D. Methods in Molecular Biology. Basic Cell Culture Protocols. Helgason, D. C., Miller, C. L. 290, Humana Press. 343-352 (2005).
  6. Tadjali, M., Zhou, S., Rehg, J., Sorrentino, B. P. Prospective Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells by Expression of an. Abcg2/GFP Allele. Stem Cells. 24, 1556-1563 (2006).
  7. Zhou, S., Schuetz, J. D., Bunting, K. D., Colapietro, A. -M., Sampath, J., Morris, J. J., Lagutina, I., Grosveld, G. C., Osawa, M., Nakauchi, H., Sorrentino, B. P. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nature Medicine. 7, 1028-1034 (2001).
  8. Chateauvieux, S. Molecular profile of mouse stromal mesenchymal stem cells. Physiological Genomics. 29, 128-138 (2007).
  9. Gregory, C. A., Prockop, D. J., Spees, J. L. Non-hematopoietic bone marrow stem cells: Molecular control of expansion and differentiation. Experimental Cell Research. 306, 330-335 (2005).
  10. Menicanin, D., Bartold, P., Zannettino, A., Gronthos, S. Genomic Profiling of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cell Reviews and Reports. 5, 36-50 (2009).
  11. Summer, R., Fitzsimmons, K., Dwyer, D., Murphy, J., Fine, A. Isolation of an Adult Mouse Lung Mesenchymal Progenitor Cell Population. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 37, 152-159 (2007).
  12. Waid, D. M. A unique T cell subset described as CD4loCD40+ T cells (TCD40) in human type 1 diabetes. Clinical Immunology. 124, 138-148 (2007).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Cytometria przepływowatrawienie tkanekHoechst low CD45 negativetest tworzenia koloniisortowanie komórekkontrola szpiku kostnegowłóknienie płucróżnicowanie mezenchymalnekonfiguracja cytometru przepływowego
Izolacja & Charakterystyka barwnika Hoechstniski CD45ujemny Mezenchymalne komórki macierzyste płuc myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.