Method Article

Izolacja i charakterystyka mezenchymalnych komórek macierzystych płuc myszy oniskim poziomie CD45 Hoechst

DOI:

10.3791/3159

⸱

October 26th, 2011

 ,  ,  ,  , 
1Charles C. Gates Regenerative Medicine and Stem Cell Biology Program, University of Colorado Denver, 2Department of Medicine, University of Colorado Denver, 3Cancer Center, University of Colorado Denver, 4Webb Waring Institute, University of Colorado Denver

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule pokazujemy izolację mysich mezenchymalnych komórek macierzystych płuc (MSC), ich ekspansję, charakterystykę i analizę właściwości immunomodulacyjnych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) rezydujące w tkankach są ważnymi regulatorami naprawy lub regeneracji tkanek, zwłóknienia, stanów zapalnych, angiogenezy i powstawania nowotworów. Podsumowując, badania te sugerują, że rezydentne MSC płuc odgrywają rolę w homeostazie, uszkodzeniu i naprawie tkanki płucnej podczas chorób takich jak zwłóknienie płuc (PF) i nadciśnienie tętnicze (PAH). W tym miejscu opisujemy technologię definiującą populację rezydentów MSC płuc. Zdefiniowanie tej populacji in vivo tkanki płucnej przy użyciu zdefiniowanego zestawu markerów ułatwia wielokrotną izolację dobrze scharakteryzowanej populacji komórek macierzystych za pomocą cytometrii przepływowej oraz badania określonego typu i funkcji komórki.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Izolacja płuc

  1. Uśmierc dorosłe myszy (w wieku 8-10 tygodni; 18-20 g; C57Bl6J) myszy z przedawkowaniem izofluranu, a następnie wykrwawieniem przy użyciu sterylnej techniki. Profile będą się nieznacznie różnić w zależności od szczepu.
  2. Chirurgicznie usuń przeponę, otwórz jamę klatki piersiowej, przecinając klatkę piersiową bocznie po każdej stronie myszy. Wypłucz krew z płuc, delikatnie perfundując prawą komorę serca za pomocą 3-5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
  3. Wypreparuj płaty płuc, usuwając tchawicę i duże oskrzela i umieść na szalce Petriego wypełnionej buforowaną solą fizjologiczną Hanksa (HBSS). Po pobraniu wszystkich płatów płuc stosuje się kleszcze do umieszczenia tkanki na wieczku naczynia. Tkanka jest następnie mielona na drobne kawałki za pomocą jednorazowych skalpeli z wystarczającą ilością płynu, aby utrzymać je wilgotne, ale nie na tyle, aby unosiły się i poruszały.
  4. Wypreparuj tylną kończynę jednej z myszy i wyizoluj szpik kostny, aby użyć go jako kontroli barwienia w celu ustawienia bramek cytometrii przepływowej. Wybarwić szpik kostny (BM) zgodnie z wcześniejszym opisem 1.

2. Przygotowanie zawiesiny pojedynczej komórki z tkanki płucnej

  1. Każde płuco jest trawione przy użyciu zoptymalizowanego stosunku masy tkanki do objętości wynoszącego 0,2 g: 5 ml wstępnie podgrzanej 0,2% kolagenazy Worthington typu 2 (Worthington Biochemicals, Lakewood, NJ; kat. # LS004202) rozpuszczonej w sterylnym HBSS. Mieszaninę zanurza się w łaźni wodnej o temperaturze 37°C na 30 minut 2,3.
  2. Próbkę należy dobrze roztrzeć, aż trawienie tkanki płucnej będzie łatwo przepływać przez pipetę o pojemności 10 ml (około 10 powtórzeń). Inkubować przez dodatkowe 15 minut w temperaturze 37°C, aby zakończyć trawienie tkanek i zapewnić bardziej jednolitą zawiesinę jednokomórkową.
  3. Rozcieńczyć zawiesinę komórek płuc HBSS i roztrzeć pipetą o pojemności 5 ml w celu rozproszenia pozostałych fragmentów tkanki.
  4. Przefiltruj zawiesinę za pomocą sitka komórkowego 70 μM, aby usunąć niestrawione fragmenty tkanki. W tym momencie próbkę można podzielić na wiele stożkowych rurek, aby zapobiec przeciążeniu jednego sitka komórkowego i skrócić czas.
  5. Zawiesinę ogniw osadzać przez 10 minut z prędkością 1500 obr./min i zdekantować supernatant.
  6. Delikatnie zawiesić osad komórkowy za pomocą buforu do lizy RBC o temperaturze pokojowej (eBiosciences, San Diego, CA; kat. # 00-4333-57) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Dodać równą objętość HBSS, aby dezaktywować bufor do lizy i przefiltrować zawiesinę komórek za pomocą sitka komórkowego 40 μM w celu usunięcia zanieczyszczeń i agregatów komórkowych.
  7. Odpipetować 10 μl każdej próbki do barwienia i policzyć liczbę komórek zarówno w próbkach płuc, jak i BM za pomocą hemocytometru. Uwaga: zapisz całkowitą objętość komórek.
  8. Zawiesinę jednokomórkową komórek płuc osadzać przez odwirowanie z prędkością 1500 obr./min przez 10 minut.
  9. Ponownie zawiesić zarówno komórki płuc, jak i BM w 1x106 komórek/ml we wstępnie podgrzanym (37°C) DMEM+ (zmodyfikowany Dulbecco's Eagle's medium, wysoki poziom glukozy (Gibco, Carlsbad, CA; kat # 11965-092) zawierający 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 10mM HEPES.
  10. Przygotować 1mg/ml roztwór podstawowy barwnika Hoechst 33342 (Sigma Chemical Company, St.Louis, MO; kat. # B2261) w wodzie i wysterylizować filtrem 1,4. Barwnik Hoechst może być przechowywany w postaci podwielokrotności w temperaturze -80°C.
  11. Dodać barwnik Hoescht 33342 do końcowego stężenia 5 μg/ml (200-krotne rozcieńczenie 1 mg/ml podstawy) do zawiesiny jednokomórkowej.
  12. Wymieszaj komórki przez delikatne odwrócenie i inkubuj w łaźni wodnej o temperaturze 37°C dokładnie przez 90 minut.

3. Barwienie i przygotowanie zawiesiny komórek płuc do analizy metodą cytometrii przepływowej

figure-protocol-1

figure-protocol-2

figure-protocol-3
&

figure-protocol-4

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dostosowaliśmy metodę początkowo stosowaną do identyfikacji komórek krwiotwórczych BM w celu wyizolowania określonej populacji rezydentnych komórek płucnych MSC. Ze względu na powtarzalność izolacji, komórki te zostały następnie dobrze scharakteryzowane jako MSC. Ich pochodzenie zostało zdefiniowane jako bytujące w płucach dorosłej myszy (w przeciwieństwie do BM pochodzących), a profil fenotypowy i molekularny został udokumentowany 2. Możliwość wielokrotnego izolowania tej scharakteryzowanej populacji pozwala na dalsze badania nad biologicznym znaczeniem i rolą MSC płuc podczas homeostazy tkanek i choroby. Niedawna definicja tej populacji in vivo zarówno w mysjej, jak i ludzkiej tkance płucnej ułatwia opracowanie strategii terapeutycznej ukierunkowanej na ratowanie komórek endogennych w celu ułatwienia naprawy płuc podczas urazów i chorób.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana z grantów dla SMM: AHA GIA0855953G, NIH 1R01 HL091105-01. Dodatkowego wsparcia udzieliły: DW: NIH RO1DK075013, DDK oraz Fundacja Kleberg; rdzeń cytometrii przepływowej UCCC (NIH 5 P30 CA 46934-15), rdzeń mikromacierzy UCCC (NCI P30 CA 46934-14).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Sigma-AldrichP-5368
Hanks buforowany roztwór soli (HBSS)Thermo Fisher Scientific, Inc.SH30588,01
0,2% kolagenaza Worthington typu 2Worthington BiochemicalLS004202
Bufor do lizy czerwonych krwinekeBioscience00-4333-57
DMEMInvitrogen11965-092
H– CHST 33342 barwnikSigma-AldrichB2261
CD45-APCBD Biosciences559864
Jodek propidynySigma-Aldrich81845
a-MEMThermo Fisher Scientific, Inc.SH30265.01
FBSInvitrogen16000-069
0,5% trypsyna/EDTACellgro25-053-Cl
Kompletny MesenCult MediumStem Cell Technologies05511
0,4% w/v roztwór barwiący GiemsaSigma-AldrichGS1L
4% paraformaldehydMikroskopia elektronowa Sciences1571016% paraformeldehydu rozcieńcza się do 4% przy użyciu
estru karboksyfluoresceiny sukcynimidylu PBS (CFSE)Sigma-Aldrich21888

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).">Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).
  2. The Pathology of Bleomycin Induced Fibrosis is Associated with Loss of Resident Lung Mesenchymal Stem Cells Which Regulate Effector T-Cell Proliferation. STEM CELLS. , (2011).">Jun, D. H. The Pathology of Bleomycin Induced Fibrosis is Associated with Loss of Resident Lung Mesenchymal Stem Cells Which Regulate Effector T-Cell Proliferation. STEM CELLS. , (2011).
  3. Adult lung side population cells have mesenchymal stem cell potential. Cytotherapy. 10, 140-151 (2008).">Martin, J. Adult lung side population cells have mesenchymal stem cell potential. Cytotherapy. 10, 140-151 (2008).
  4. Distinct progenitor populations in skeletal muscle are bone marrow derived and exhibit different cell fates during vascular regeneration. The Journal of Clinical Investigation. 111, 71-79 (2003).">Majka, S. M. Distinct progenitor populations in skeletal muscle are bone marrow derived and exhibit different cell fates during vascular regeneration. The Journal of Clinical Investigation. 111, 71-79 (2003).
  5. Basic Cell Culture Protocols. Helgason, D. C., Miller, C. L. 290, Humana Press. 343-352 (2005).">Goodell, M. A., McKinney-Freeman, S., Camargo, F. D. Methods in Molecular Biology. Basic Cell Culture Protocols. Helgason, D. C., Miller, C. L. 290, Humana Press. 343-352 (2005).
  6. Prospective Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells by Expression of an. Abcg2/GFP Allele. Stem Cells. 24, 1556-1563 (2006).">Tadjali, M., Zhou, S., Rehg, J., Sorrentino, B. P. Prospective Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells by Expression of an. Abcg2/GFP Allele. Stem Cells. 24, 1556-1563 (2006).
  7. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nature Medicine. 7, 1028-1034 (2001).">Zhou, S., Schuetz, J. D., Bunting, K. D., Colapietro, A. -M., Sampath, J., Morris, J. J., Lagutina, I., Grosveld, G. C., Osawa, M., Nakauchi, H., Sorrentino, B. P. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nature Medicine. 7, 1028-1034 (2001).
  8. Molecular profile of mouse stromal mesenchymal stem cells. Physiological Genomics. 29, 128-138 (2007).">Chateauvieux, S. Molecular profile of mouse stromal mesenchymal stem cells. Physiological Genomics. 29, 128-138 (2007).
  9. Non-hematopoietic bone marrow stem cells: Molecular control of expansion and differentiation. Experimental Cell Research. 306, 330-335 (2005).">Gregory, C. A., Prockop, D. J., Spees, J. L. Non-hematopoietic bone marrow stem cells: Molecular control of expansion and differentiation. Experimental Cell Research. 306, 330-335 (2005).
  10. Genomic Profiling of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cell Reviews and Reports. 5, 36-50 (2009).">Menicanin, D., Bartold, P., Zannettino, A., Gronthos, S. Genomic Profiling of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cell Reviews and Reports. 5, 36-50 (2009).
  11. Isolation of an Adult Mouse Lung Mesenchymal Progenitor Cell Population. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 37, 152-159 (2007).">Summer, R., Fitzsimmons, K., Dwyer, D., Murphy, J., Fine, A. Isolation of an Adult Mouse Lung Mesenchymal Progenitor Cell Population. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 37, 152-159 (2007).
  12. A unique T cell subset described as CD4loCD40+ T cells (TCD40) in human type 1 diabetes. Clinical Immunology. 124, 138-148 (2007).">Waid, D. M. A unique T cell subset described as CD4loCD40+ T cells (TCD40) in human type 1 diabetes. Clinical Immunology. 124, 138-148 (2007).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Lung Mesenchymal Stem CellsFlow CytometryTissue DigestionHoechst Low CD45 NegativeColony Forming AssayCell SortingBone Marrow ControlPulmonary FibrosisMesenchymal DifferentiationFlow Cytometry Setup

Related Articles