Wizualizacja splotu naczyniówkowego mózgu myszy za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

Streszczenie

Źródło: Van Wonterghem, E., et al. Mikrodysekcja i wizualizacja skaningowej mikroskopii elektronowej myszy z całego mocowania. J. Vis. Exp. (2022)

Ten film przedstawia przygotowanie i obrazowanie tkanki splotu naczyniówkowego z mózgu myszy za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Proces obejmuje utrwalanie, odwadnianie i powlekanie tkanki przewodzącą warstwą platyny w celu stabilizacji i przygotowania próbki do obrazowania. SEM rejestruje szczegółowe obrazy komórek nabłonka z mikrokosmkami, zapewniając wgląd w cechy strukturalne tkanki.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Analiza morfologiczna tkanki splotu naczyniówkowego (CP) za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM)

UWAGA: W następujących etapach przetwarzania stosuje się roztwory toksyczne. Zaleca się przygotowanie próbki w dygestorium.

1. Wykonaj przygotowanie próbki do SEM zgodnie z poniższym opisem.
   1. Przenieść świeżo wyizolowany CP do świeżo przygotowanego roztworu utrwalającego zawierającego 2% paraformaldehydu i 2,5% aldehydu glutarowego w 0,1 M buforze Na-kakodylanu (pH 7,4). Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Ponieważ tkanka CP jest bardzo delikatna i cienka, tkankę należy umieścić w małych koszyczkach na próbki (patrz Tabela materiałów), aby przenieść ją między buforami. W ten sposób struktura tkanki zostanie lepiej zachowana. Utrwalacz na bazie kakodylatu stosuje się zamiast utrwalacza na bazie soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), ponieważ silny bufor kakodylowy może przeciwdziałać niskiemu pH aldehydu glutarowego w utrwalaczu EM.
   2. Przemyć próbkę 3x przez 5 minut każdy, 3-5 ml 0,1 M buforu Na-kakodylanu (pH 7,4).
   3. Po utrwaleniu próbek w 3-5 ml 2% tetratlenku osmu w 0,1 M buforze Na-kakodylanu przez 30 minut. Próbki należy przemywać 3x po 5 minut w 3-5 ml ultraczystej wody.
   4. Odwodnić próbki w serii lodowatych roztworów o rosnącym stężeniu etanolu (EtOH) (50%, 70%, 85%, 100%) przez 15 minut na roztwór EtOH. Użyj osuszacza do punktu krytycznego, aby prawidłowo wysuszyć próbkę punktowo. UWAGA: Zmiana fazy z ciekłej na gazową wpływa na napięcie powierzchniowe, powodując uszkodzenie struktury powierzchni. Etap suszenia w punkcie krytycznym pozwala na zachowanie struktury powierzchni.
   5. Ostrożnie umieść próbkę na uchwycie próbki dostarczonym z naklejką węglową (patrz Tabela materiałów).
   6. Próbki należy pokryć cienką warstwą (2-5 nm) platyny. W tym celu należy zamontować źródło platyny w układzie próżniowym między dwoma wysokoprądowymi zaciskami elektrycznymi i podgrzać platynę do temperatury parowania. Drobny strumień platyny osadza się na próbce. UWAGA: Oprócz platyny, można również użyć złota lub złota/palladu.
2. Wizualizacja próbek CP za pomocą SEM (patrz Tabela materiałów). Procedura wizualizacji tkanki CP za pomocą SEM jest podobna do procedury innych typów tkanek i zależy od użytego oprogramowania i instrumentów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Aluminiowe mocowania próbek	EM Sciences	75220
Bufor kakodylatowy	EM Sciences	11652
Zakładki z kleju węglowego -12 mm	EM Sciences	77825-12
Suszarka punktu krytycznego	Bal-Tec	CPD030
Belka poprzeczna 540	System SEM Zeiss
Kleszcze	Fine Science Tools GmbH	91197-00
Aldehyd glutarowy	EM Sciences	16220
Tetratlenek osmu	EM Sciences	19170
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	P6148
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Lonza	BE17-516F
Platynowe	kworum	Q150T ES	PBS bez Ca⁺⁺, Mg⁺⁺ lub czerwieni fenolowej; sterylny filtrowany
Kosz na próbki Stal nierdzewna	EM Sciences	70190-01