Ten film demonstruje obrazowanie wapnia w czasie rzeczywistym w celu monitorowania aktywności synaptycznej w neuronach z mutacją ALS wyrażających genetycznie kodowany bioczujnik wapnia. Przedstawiono w nim etapy przygotowania neuronów do obrazowania, stymulowania dynamiki wapnia i rejestrowania fluorescencji w celu pomiaru zmian w czasie rzeczywistym wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia, które odzwierciedlają aktywność synaptyczną neuronów.
1. Obrazowanie fluorescencyjne stanów przejściowych wapnia Gcamp6m
Transfekcja pierwotnych neuronów korowych gryzoni hodowanych na 35-milimetrowych naczyniach ze szklanym dnem z 500 ng Gcamp6m. UWAGA: W razie potrzeby należy współtransfekować neurony z plazmidem będącym przedmiotem zainteresowania zawierającym znacznik fluorescencyjny w zakresie czerwonym lub dalekiej czerwieni.
Inkubuj neurony za pomocą sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF) o niskiej zawartości chlorku potasu (KCl) (Tabela 1) przez 15 minut, 48 godzin po transfekcji, a następnie zamontuj szalkę na platformie obrazowania.
Wizualizacja fluorescencji GCaMP6m za pomocą filtra izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) (488 nm) i obiektywu 20x lub 40x.
Wybierz pole obrazowania i ustaw idealną ostrość. Następnie zrób pojedynczy nieruchomy obraz z kanałami jasnego pola, FITC i markerów fluorescencyjnych, aby zaznaczyć granice neuronów.
Zainicjuj polecenie Uruchom teraz w oprogramowaniu do pozyskiwania. Przeprowadzić zapis linii podstawowej przez 5 minut, a następnie przeprowadzić perfuzję z płynem CSF zawierającym 50 mM KCL (Tabela 1). UWAGA: Celem tego obrazowania jest pomiar wywołanych stanów przejściowych wapnia. Jeśli neuron ma podstawową aktywność wypalania i strumienie wapnia w okresie przed stymulacją, nie jest on wykorzystywany w analizie danych. Zamiast tego używane są tylko komórki o stabilnej fluorescencji tła. Okresy po stymulacji można również wydłużyć do 60 minut w przypadku stanów przejściowych wapnia, z dodatkową ciągłą perfuzją o wysokim KCl lub bez niej.
Zapisz eksperyment i przeanalizuj dane za pomocą oprogramowania konfokalnego. W tym momencie eksperyment może zostać przerwany, a analizę można przeprowadzić później. UWAGA: Jeśli komórki nie wymagają transfekcji w celu ekspresji białek będących przedmiotem zainteresowania, protokół ten można przeprowadzić w dowolnym momencie in vitro, gdy ma się na celu zbadanie stanów przejściowych wapnia. Po przeprowadzeniu testu na komórkach kontrolnych w celu zapewnienia pomiaru stanów przejściowych wapnia, eksperymentator powinien być ślepy na warunki genetyczne lub farmakologiczne każdej badanej potrawy, aby zminimalizować błąd systematyczny.
2. Analiza obrazu
Otwórz zdjęcia poklatkowe za pomocą oprogramowania konfokalnego.
Wyrównaj obrazy w seriach poklatkowych za pomocą serii poleceń: Obraz | Przetwarzanie | Wyrównaj bieżący dokument.Wybierz opcję Wyrównaj do pierwszej klatki.
Wybierz obszary zainteresowania (ROI) wzdłuż neurytów za pomocą narzędzia do zaznaczania ROI, ikony w kształcie fasoli po prawej stronie ramki obrazu. Zaznacz również ROI reprezentujący intensywność fluorescencji tła. UWAGA: ROI są wybierane, wybierając obszary wyraźnie oddzielonych puncta wzdłuż ścieżek neuronalnych wskazanych przez nieruchomy obraz w jasnym polu. Do analizy wybiera się co najmniej pięć ROI na neuron. Tło ROI jest wybierane w regionie pola widzenia, który nie zawiera neurytów.
Zmierz surową fluorescencję w czasie dla wybranych ROI za pomocą następującej serii poleceń: Pomiar | Pomiar czasu.
Uruchom funkcję Miara w górnej części panelu Pomiar czasu. Generowana jest zarówno graficzna reprezentacja surowej fluorescencji w czasie, jak i dane ilościowe. UWAGA: Każdy punkt danych reprezentuje surową fluorescencję dla tego zwrotu z inwestycji dla klatki powiązanej z tym konkretnym zmierzonym punktem czasowym.
Eksportuj surowe intensywności fluorescencji do oprogramowania arkusza kalkulacyjnego.
Tabela 1: Skład buforów sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF).
Low KCL aCSF buffer (pH 7,40 do 7,45)
Stężenie
odczynnika
HEPES
10 mM
NaCl
140 mM
KCl
5 mM
Glukoza
10 mM
CaCl2 2H2
O 2
mM MgCl2 4H2O
1 mM
Bufor aCSF o wysokim KCL (pH 7,40 do 7,45)
Stężenie odczynnika
HEPES
10 mM
NaCl
95 mM
KCl
50
mM Glukoza
10 mM
CaCl2 2H2O
2
mM MgCl2 4H2O
1 mM
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa
Firma
Numer katalogowy
Komentarze
20x obiektyw powietrznyNikon Do obrazowania40-krotny obiektyw immersyjny z olejkiemNikon Do obrazowaniasuplement B27Thermo Scientific17504044Suplement na wzrost neuronówStrzykawki BD bez igły, 50 mlThermo Scientific13-689-8Część zespołu perfuzji grawitacyjnejKaptur do hodowli komórek bezpieczeństwa biologicznegoBakerSterilGARD III SG403AHodowla komórek asceptycznych, transfekcja i ładowanie barwnikaBeta-merkaptoetanolMillipore SigmaM3148Do hodowli i utrzymania kultur neuronalnychSurowica bydlęca AlbuminaMillipore SigmaA9418Do przygotowania kultur neuronalnychDwuwodny chlorek wapniaMillipore Sigma223506Składnik roztworów aCSFInkubator dwutlenku węgla do hodowli komórkowychThermo Scientific13-998-123Do hodowli i utrzymania neuronówMikroskop konfokalnyNikonEclipse Ti + A1Rrdzeń Do obrazowania fluorescencyjnegoKamera CCD CoolSNAP ES2Fotometria Do akwizycji obrazuD-GlucoseMillipore SigmaG8270Składnik roztworów CSFFITC Kostka filtraNikon77032509Do obrazowania stanów przejściowych wapnia GcampSzklane dno szalki Petriego (Grubość #1,5)CellVisD35-10-1.5-NDo wzrostu neuronów na misce hodowlanej zgodnej z obrazowaniemHEPESMillipore SigmaH3375Składnik roztworów aCSFSztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy o wysokim KCl (aCSF) Do obrazowania.Surowica końskaMillipore SigmaH1138Do hodowli i utrzymania neuronówLamininThermo Scientific23017015Do przygotowania kultur neuronalnychLeibovitz L-15 MediumThermo Scientific11415064Do przygotowania kultur neuronalnychLeibovitz'sL-15 Medium, bez czerwieni fenolowejThermo Scientific21083027Do przygotowania neuronów kulturyL-Glutamina (200 mM)Thermo Scientific25030149Suplement do hodowli neuronówLipofectamina 2000 Odczynnik do transfekcjiThermo Scientific11668019Do transfekcji neuronalnychSztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy o niskiej zawartości KCl (aCSF) Do obrazowania.Chlorek magnezuMillipore Sigma208337Składnik roztworów CSFMicrosoft ExcelMicrosoft Oprogramowanie do analizy/normalizacji danychJednostki filtrujące Nalgene, 0,2 μm PESThermo Scientific565-0020Jednostka filtrująca do roztworu CSFPożywka neurobazalnaThermo Scientific21103049Do hodowli i utrzymania hodowle neuronówNIS-Elements Zaawansowane badaniaNikon Oprogramowanie do przechwytywania i analizy obrazówNunc 15 ml Rurki stożkoweThermo Scientific339650Do przygotowania kultur neuronalnych i roztworów buforowych Rurkistożkowe Nunc 50 mlThermo Scientific339652Do przygotowania hodowli neuronów i roztworów buforowychOptiprepMillipore SigmaD1556Do przygotowania kultur neuronalnychPapainaMillipore SigmaP4762Do przygotowania kultur neuronalnychPenicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)Thermo Scientific15140122Aby zapobiec zanieczyszczeniu bakteryjnemu kultur neuronalnychSystem perfuzyjnyWarner InstrumentsSF-77BDo wymiany rurki perfuzyjnej aCSFCole-ParmerUX-30526-14Część zespołu perfuzji grawitacyjnejplazmid pGP-CMV-Gcamp6mAddgene40754Do obrazowania stanów przejściowychwapnia Bromowodorek poli-D-lizynyMillipore SigmaP7886Środek powlekający do szalek Petriego ze szklanym dnemChlorek potasuMillipore SigmaP3911Składnik roztworów aCSFWodorowęglan soduMillipore SigmaS5761Składnik roztworów aCSFChlorek soduMillipore SigmaS9888Składnik roztworów aCSFStage Top InkubatorTokai Hit Do inkubacji żywych neuronów w okresie obrazowaniaKostka filtra TRITCNikon77032809Do obrazowania FM4-64Tabela izolacji drgańNowy portVIP320X2430-135520Stół/stojak do mikroskopu
Przedruki i uprawnienia
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE