Dwufotonowa mikroskopia holograficzna do badania aktywności neuronalnej i łączności w modelu mysim

Streszczenie

Źródło: Kato, D. et. al., Ocena i manipulacja aktywnością neuronalną za pomocą dwufotonowej mikroskopii holograficznej. J. Vis. Exp. (2022)

Ten film przedstawia technikę obrazowania dwufotonowego w połączeniu z optogenetyką przy użyciu mikroskopii holograficznej. Technika ta, wykorzystująca przestrzenny modulator światła, umożliwia precyzyjną stymulację neuronów polegającą na ekspresji białka wrażliwego na światło czerwone i obrazowanie wapnia przy minimalnym fotouszkodzeniu. Takie podejście zapewnia wgląd w funkcjonalną łączność i organizację sieci neuronowych.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Implantacja płytki głowy (ryc. 1A)

1. Podać środek znieczulający (mieszanina 74 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny) dootrzewnowo w celu znieczulenia myszy. Często sprawdzaj stan znieczulenia myszy, oceniając odruchy pedałowania.
2. Po znieczuleniu umieść mysz w instrumencie stereotaktycznym. Nałóż maść do oczu (patrz Tabela materiałów), aby zapobiec wysychaniu rogówki podczas wszczepiania płytki głowy.
3. Ogolić obszar operacyjny i zdezynfekować skórę trzema naprzemiennymi rundami peelingów powidonowo-jodowych lub chlorheksydynowych, a następnie chusteczkami nasączonymi 70% alkoholem. Ostrożnie odsłoń czaszkę i wyczyść ją wacikami.
   UWAGA: Wszystkie narzędzia chirurgiczne powinny być wysterylizowane, a wszystkie zabiegi powinny być wykonywane zgodnie z tym. Wszelkie pozostałe zanieczyszczenia (np. włosy lub zaschnięta krew) powodują reakcje zapalne. Dlatego wszelkie zanieczyszczenia należy usunąć pod stereoskopem za pomocą bawełnianych wacików zwilżonych sterylną wodą lub 70% alkoholem.
4. Użyj współrzędnych stereotaktycznych - przednie i tylne = 0,5 mm, przyśrodkowe i boczne = 1,5 mm od bregmy - aby znaleźć środek kraniotomii i oznaczyć go markerem.
5. Umieść wykonaną na zamówienie płytę na głowę na środku czaszki. Następnie nałóż cement dentystyczny (patrz Tabela materiałów), aby mocno przymocować go do czaszki. Wywieraj lekki nacisk, aż płyta głowy mocno zetknie się z przodem i tyłem czaszki.
   UWAGA: Ten krok zajmuje około 20 minut i ma kluczowe znaczenie dla redukcji artefaktów ruchu w mózgu podczas obrazowania dwufotonowego. Wymiary płyty czołowej wynoszą 20 mm × 40 mm × 1 mm z otworem w kształcie płyty głównej z jedną krawędzią o długości 15 mm, dwoma sąsiednimi bokami o długości 3 mm i pozostałymi dwoma bokami o długości 10 mm.
6. Wymieszaj cement z żywicy adhezyjnej na bazie akrylu w następujący sposób: pół łyżki proszku, trzy krople płynu i jedna kropla katalizatora (patrz Tabela materiałów). Aby zapobiec wysuszeniu, nałóż ten zmieszany cement z żywicy adhezyjnej na nienaruszoną powierzchnię czaszki myszy za pomocą płytki głowy.
7. Umieść mysz w ciepłej klatce, aż wyzdrowieje ze znieczulenia. Nie pozostawiaj myszy bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka.

2. Chirurgia i wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem (AAV) (ryc. 1B)

1. Wykonaj kraniotomię lub wstrzyknięcie wirusa bez usuwania cementu z żywicy adhezyjnej z czaszki 1 dzień po implantacji płytki głowy.
   UWAGA: Podaj znieczulenie (mieszanina 74 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny) dootrzewnowo myszy podczas tej procedury.
2. Aby uniknąć obrzęku mózgu, należy podawać deksametazon fosforanu sodu (1,32 mg/kg) dootrzewnowo na 1 godzinę przed zabiegiem.
3. Znieczulij mysz za pomocą płytki czołowej 1% znieczuleniem izofluranem za pomocą waporyzatora (system dostarczania znieczulenia), jednocześnie utrzymując temperaturę ciała za pomocą poduszki grzewczej. Nałóż maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.
4. Pod stereoskopem wykonaj okrężną kraniotomię o średnicy około 2 mm za pomocą wiertła dentystycznego. Aby zmniejszyć uszkodzenie mózgu, należy ostrożnie obsługiwać wiertło dentystyczne, wykonując stały lekki ruch i lekko naciskając w dół.
5. Usuń fragmenty kości kilka razy za pomocą systemu ssącego. Po usunięciu fragmentów kości użyj roztworu sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF), aby usunąć i zmyć wszelkie zanieczyszczenia pozostałe na powierzchni mózgu. Powtórz tę procedurę czyszczenia kilka razy, aby stłumić reakcje zapalne.
   UWAGA: Roztwór ACSF (140 mM chlorek sodu, NaCl, 2,5 mM chlorek potasu, KCl, 5 mM kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy, HEPES, 2,0 mM chlorek wapnia, CaCl₂ i 1,0 mM chlorek magnezu, MgCl₂) przechowywano w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc po rozpuszczeniu i przefiltrowaniu odczynnika (wielkość porów = 0,22 μm).
6. Korzystając z systemu wtrysku ciśnieniowego (patrz Tabela materiałów), ustaw odpowiednie ciśnienie (około 10 funtów na cal kwadratowy (PSI) w impulsach o czasie trwania 4 ms), aby wstrzyknąć 500 nL roztworu AAV przez szklaną kapilarnę o średnicy końcówki 10-20 μm (przygotowanej za pomocą ściągacza do mikropipet) przez 10 minut.
7. Określ, czy roztwór AAV jest podawany do mózgu przez sprawdzenie, czy poziom roztworu AAV w szklanej kapilarze stopniowo spada.
8. Pozostaw szklaną kapilarnę na miejscu na dodatkowe 10 minut, aby zapobiec przepływowi wstecznemu. Powtórz trzy razy, aby podać w sumie 1,5 μl roztworu AAV do mózgu.
9. Aby ocenić i manipulować aktywnością neuronalną w komórkach piramidowych warstwy 2/3 (L2/3), wstrzyknąć roztwór AAV (dla obrazowania Ca²⁺: AAV2/1-Syn-jGCaMP8f-WPRE przy 1,28 × 10¹⁴ genomach/ml, rozcieńczonych 1:1 w soli fizjologicznej; dla obrazowania Ca²⁺ z optogenetyką: AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1-WPRE przy 1,73 × 10¹⁴ genomach wektorowych/mL, rozcieńczony w stosunku 1:1 w soli fizjologicznej) do obszaru tylnej łapy pierwszorzędowej kory somatosensorycznej myszy typu dzikiego (S1, wyśrodkowany na 0,5 mm z tyłu i 1,5 mm z boku od bregmy, głębokość 150 μm od powierzchni).
   UWAGA: Roztwór AAV należy wstrzyknąć na 2-3 tygodnie i 1-2 tygodnie przed obrazowaniem odpowiednio pod kątem ekspresji jGCaMP8f i GCaMP6m-P2A-ChRmine.
10. Po nałożeniu 2% (w/v) niskotopliwej agarozy na powierzchnię mózgu S1 za pomocą mikropipety, umieść szklane okienko nad kraniotomią z dwoma szkłami nakrywkowymi. Przymocuj dwie szklanki nakrywkowe (mała średnica 2,0 mm i duża średnica 4,5 mm; patrz Tabela materiałów) za pomocą kleju utwardzanego ultrafioletem (UV).
11. Dociśnij szklankę nakrywkową do agarozy, gdy jest jeszcze płynna; Zapobiega to tworzeniu się pęcherzyków powietrza w agarozie. Uszczelnij krawędzie okna czaszki cementem z żywicy dentystycznej i adhezyjnej (Rysunek 1C).
12. Wyjmij mysz z instrumentu stereotaktycznego i umieść ją z powrotem w klatce. Umieść mysz w ciepłej klatce i nie wracaj do klatki z innymi zwierzętami, dopóki w pełni nie wyzdrowieje ze znieczulenia. Ostrożnie utrzymuj sterylne warunki podczas operacji przeżycia.
13. Przez pierwsze 72 godziny po zabiegu sprawdzaj stan zdrowia myszy, obserwując ogólne zachowanie. Jeśli występują jakiekolwiek nieprawidłowości w ogólnym zachowaniu, należy wstrzyknąć podskórnie środki przeciwzapalne i przeciwbólowe.

3. Przygotowanie do systemu stymulacji lub oświetlenia holograficznego (Rysunek 2)

1. Skalibruj system stymulacji holograficznej, umieszczając powierzchnię czerwonego szkiełka fluorescencyjnego (odlewane podłoże akrylowe) na płaszczyźnie próbki. Przełącz mikroskop w tryb obrazowania na żywo ze słabym światłem wzbudzenia i uruchom plik calibration_GUI.m. Sprawdź panel parametrów i kliknij przycisk Zapisz .
2. Kliknij przycisk Z Scan w okienku kroku 1. Automatycznie wygeneruje trzy losowe punkty we wszystkich 21 płaszczyznach osiowych, w odległości 2 μm od każdej płaszczyzny.
3. Przesuń suwak i sprawdź obraz na żywo. Znajdź idealną płaszczyznę, w której plamy wydają się najmniejsze i najjaśniejsze, a następnie kliknij przycisk Zapisz . Spowoduje to automatyczne wygenerowanie przesuniętego sferycznego czoła fali dla hologramu cyfrowego.
   UWAGA: Jeśli nie uda Ci się znaleźć najjaśniejszych plamek fluorescencyjnych, zmień minimalne i maksymalne wartości zakresu skanowania i spróbuj ponownie.
4. Kliknij przycisk Go w okienku kroku 2, a następnie kliknij sześć miejsc w lewym kwadracie. Sprawdź obraz na żywo. Jeśli istnieje sześć rozpoznawalnych punktów fluorescencyjnych, wpisz ich osie x i y w polach edycji i kliknij przycisk Zapisz . Spowoduje to automatyczne wygenerowanie współczynników transformacji afinicznej w celu skoordynowania kalibracji między stymulacją holograficzną a systemem obrazowania.
   UWAGA: Numer pary osi i numer klikniętego punktu muszą być dopasowane w kolejności. Jeśli nie masz pewności lub jeśli na obrazie nie ma plam, spróbuj ponownie i wygeneruj unikalny wzór plamki lub wybierz mniejszy zakres wokół środka pola widzenia (FOV).
5. Kliknij przycisk Skanuj w okienku kroku 3. Wygeneruje 441 cyfrowych hologramów, aby wykonać skanowanie pojedynczego punktu w polu widzenia w 21 × 21 krokach.
   1. Najpierw sprawdź obrazy podczas zmiany wzorów w polu listy. Następnie dostosuj moc lasera, aby uzyskać obrazy punktowe w zakresie dynamicznym urządzenia do obrazowania (na przykład, aby uniknąć nadmiernego nasycenia obrazów).
   2. Następnie dostosuj czas interwału w polu edycji; Czas interwału powinien być ponad dwukrotnie większy niż czas interwału nagrywania. Na koniec przełącz urządzenie do przetwarzania obrazu w tryb nagrywania i kliknij przycisk Odtwórz . Jeśli odtwarzanie zostanie zakończone, w oknie poleceń pojawią się napisy "wyświetl OK". Zatrzymaj nagrywanie i ułóż nagrane obrazy sekwencyjne w stos przy użyciu metody maksymalnej intensywności.
6. Kliknij Generuj WM w okienku kroku 4 i wybierz obraz piętrowy z góry. Następnie zamknij okno calibration_GUI. Automatycznie wygeneruje mapę wagi, aby skompensować niezrównoważoną intensywność w każdym miejscu.
   UWAGA: Aby uzyskać bardziej szczegółowy opis, kod MATLAB można pobrać stąd (https://github.com/ZenKG/SLM_control).

4. Obrazowanie Ca²⁺ za pomocą czujnika obrazu z oświetleniem holograficznym (Rysunek 3)

1. Umieść mysz z wstrzykniętą krwią z AAV z płytką na głowę pod mikroskopem (Rysunek 1D).
   UWAGA: Podczas tej procedury mysz jest skrępowana w stanie czuwania, ale jest w stanie uciec od nieprzyjemnych bodźców.
2. Wykonaj obrazowanie dwufotonowe (tryb skanowania punktowego) za pomocą mikroskopu holograficznego i laserowego Ti: szafirowego lasera Ti z blokadą modów dostrojonego do 920 nm z obiektywem 25x (patrz Tabela materiałów).
3. Włącz komercyjne oprogramowanie do obrazowania (patrz Tabela materiałów). W trybie obrazowania na żywo dostosuj napięcie detektora obrazu (patrz Tabela materiałów) i moc lasera obrazującego, aby zoptymalizować jasność neuronów wyrażających jGCaMP8f. Uchwyć obrazy neuronów wyrażających to białko.
   UWAGA: Natężenie lasera obrazującego (920 nm) wynosi 20-30 mW. Pole widzenia wynosiło 512 μm × 512 μm na głębokości 100-150 μm od powierzchni kory mózgowej.
4. Aby oświetlić określone neurony wyrażające jGCaMP8f za pomocą oświetlenia holograficznego, uruchom plik skryptu SLMcontrol.m. Kliknij Obraz referencyjny i wybierz obraz uzyskany powyżej. Następnie kliknij przycisk Spot , aby wybrać określone piksele na neuronach na obrazie, klikając ciągłym myszką (Rysunek 3A). Jeśli wybór jest zakończony, naciśnij przycisk Enter na klawiaturze, aby go sfinalizować.
   UWAGA: Cyfrowy hologram jest automatycznie obliczany i wyświetlany na przestrzennym modulatorze światła (SLM). Do tego wzorca można również powrócić, klikając pole listy. Rozdzielczość przestrzenna pojedynczej plamki generowanej przez SLM wynosiła około 1,2 μm wzdłuż kierunku poprzecznego i ~8,3 μm wzdłuż osi optycznej. Użyliśmy soczewki obiektywowej o wysokiej aperturze numerycznej (1,1), aby uzyskać bardziej zlokalizowaną stymulację holograficzną.
5. Aby wykryć aktywność neuronalną z wysoką rozdzielczością czasową za pomocą czujnika obrazu (patrz Tabela materiałów), ustaw czas ekspozycji, obszar obrazowania i binning (Rysunek 3B) przed wykonaniem akwizycji obrazu (Rysunek 3C).
   UWAGA: Intensywność holograficznego lasera oświetleniowego (920 nm), który w sposób ciągły stymuluje jeden neuron, wynosi 2 mW, co jest wystarczające do wykrycia aktywności neuronalnej. Na przykład, aby osiągnąć częstotliwość odświeżania 100 Hz dla obrazowania, czas ekspozycji wynosi 9 ms, obszar obrazowania wynosi 400 μm × 400 μm, a binning wynosi 4.
6. Po eksperymencie przywróć mysz do jej domowej klatki.

5. Obrazowanie dwufotonowe (tryb skanowania punktowego) z optogenetyką przy użyciu mikroskopu holograficznego (Rysunek 4)

1. Powtórz kroki 4.1 i 4.2.
2. Włącz komercyjne oprogramowanie do obrazowania (patrz Tabela materiałów). W trybie obrazowania na żywo dostosuj napięcie detektora obrazu (patrz Tabela materiałów) i moc lasera obrazującego, aby zoptymalizować jasność neuronów wyrażających GCaMP6m-P2A-ChRmine. Uchwyć obrazy neuronów wyrażających te białka (Rysunek 1E).
3. Powtórz krok 4.4.
4. Aby zbadać funkcjonalną łączność w neuronach L2/3, użyj SLM do generowania holograficznych wzorców stymulacji optogenetycznej (ChRmine; 1,040 nm) i połącz je z obrazowaniem dwufotonowym Ca²⁺ (GCaMP6m; 920 nm, 512 × 512 pikseli, 2 Hz lub 30 Hz, 2-krotny zoom cyfrowy, tryb skanowania punktowego; Rysunek 3D-H).
   1. Dla tego protokołu ustaw intensywność lasera obrazującego na 920 nm, przy 10-20 mW, a FOV na 256 μm × 256 μm mierzoną na głębokości 100-150 μm od powierzchni kory mózgowej. Ustaw czas przebywania piksela na 1,5 μs dla 2 Hz lub 100 ns dla 30 Hz.
   2. Aby sprawdzić, czy pojedynczy bodziec holograficzny spowodował odpowiedź wapniową w neuronach, użyj zarówno 2 Hz, jak i 30 Hz jako częstotliwości obrazowania. Ustaw intensywność lasera do stymulacji holograficznej (1,040 nm), który stymuluje pojedynczy neuron na poziomie 10 mW, co jest wystarczające do wywołania aktywności neuronalnej (Rysunek 3D).
      UWAGA: Rozdzielczość przestrzenna pojedynczej plamki generowanej przez SLM wynosi około 1,2 μm wzdłuż kierunku poprzecznego i ~8,3 μm wzdłuż osi optycznej. Zakres dostępnej objętości w kierunku poprzecznym wynosi około 500 μm × 500 μm i 100 μm w kierunku osiowym. Ponadto potwierdziliśmy za pomocą obrazowania Ca²⁺ przy częstotliwości obrazowania 2 Hz lub 30 Hz, że nie tylko jeden neuron, ale wiele neuronów może być jednocześnie stymulowanych holograficznie (Rysunek 3E).
5. Wykonaj akwizycję obrazu za pomocą następującego protokołu: jednocześnie zobrazuj odpowiedź Ca²⁺ przy 920 nm z 10 bodźcami holograficznymi przy 1,040 nm w odstępach 8 s (0,125 Hz) przez czas trwania 50 ms po okresie bazowym wynoszącym 10 s.

Wyniki

Rysunek 1: Schematyczny zarys procedury doświadczalnej. (A) Mocowanie płyty głowy do czaszki. (B) Stereotaktyczne wstrzyknięcie AAV w obszar tylnej łapy pierwszorzędowej kory somatosensorycznej (S1HL). (C

Materiały