Obrazowanie wapnia w czasie rzeczywistym przyśrodkowej kory przedczołowej myszy za pomocą miniskopu

Streszczenie

Źródło: Thapa, R., et. al., Stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa i implantacja soczewki o indeksie gradientowym dla głębokiego mózgu In vivo Obrazowanie wapnia. J. Vis. Exp. (2021)

Film demonstruje obrazowanie wapnia w czasie rzeczywistym za pomocą miniskopu u transdukowanej myszy, korelując aktywność neuronów z zachowaniem.

Protokół

Montaż miniskopu i in vivo Ca²⁺ obrazowanie (Rysunek 1)

1. Zamontuj miniskop do podstawy
   1. Znieczul mysz na krótko w komorze indukcyjnej (5% izofluranu i natężenie przepływu tlenu 1 l/min). Umieść mysz na czystej powierzchni ławki.
   2. Poluzuj śrubę blokującą małym śrubokrętem, zdejmij nasadkę ochronną i wyczyść powierzchnię soczewki GRIN (soczewka z indeksem gradientu) wacikiem nasączonym acetonem.
   3. Owiń szczelnie taśmę PTFE (taśmę politetrafluoroetylenową) wokół gwintu miniskopu i przymocuj miniskop do podstawy na główce myszy.
   4. Podłącz miniskop do kabla (Rysunek 2K) i włącz oprogramowanie NeuView.
   5. W NeuView kliknij Hardware, zaznacz LED1 i kliknij Stream , aby wyświetlić obrazy na żywo (Rysunek 3A).
   6. Zidentyfikuj najlepszą płaszczyznę ogniskowej, regulując położenie miniskopu względem podstawy, lekko dokręcając lub poluzowując za pomocą tępych kleszczy.
      UWAGA: Najlepszą płaszczyznę ogniskową określa się poprzez porównanie kilku możliwych lokalizacji i wybranie tej z wyraźną wizualizacją większości ciał komórek.
   7. Dokręć śrubę blokującą i umieść mysz z powrotem w klatce domowej.
   8. W NeuView dostosuj moc światła LED do optymalnego poziomu. Kliknij Capture , a następnie Trigger przyciski, aby rozpocząć nagrywanie i naciśnij Zatrzymaj po 150 klatek.
      UWAGA: Najniższa możliwa moc określa optymalny poziom mocy diody LED do uzyskania wystarczająco jasnego obrazu. Celem nagrania krótkiego filmu jest ułatwienie identyfikacji tej samej płaszczyzny ogniskowej w przyszłości w celu powtarzalnego obrazowania.
   9. Odłącz kabel od miniskopu. Pozwól myszy dojść do siebie przez co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem eksperymentu.
      UWAGA: Aby chronić miniskop, zazwyczaj butelka z wodą i druciany podajnik żywności są usuwane w tym krótkim czasie. Jeśli mysz musi pozostać w klatce domowej przez dłuższy czas, zaleca się zaopatrzenie się w dostępny w handlu żel dietetyczny (patrz Tabela materiałów) w klatce domowej.
2. Akwizycja danych do obrazowania wapnia in vivo obrazowania wapnia
   UWAGA: In vivo, obrazowanie wapnia może być prowadzone jednocześnie wraz z dowolnymi testami zachowania, których życzy sobie badacz. Dla celów demonstracyjnych posłużymy się tutaj obrazowaniem in vivo Ca²⁺ podczas testu w terenie otwartym. Aby osiągnąć ten cel, potrzebne są dwa komputery. Jeden komputer jest wyposażony w komercyjne oprogramowanie (patrz Tabela materiałów) do sterowania kamerą w celu automatycznego rejestrowania zachowania myszy. Drugi komputer jest wyposażony w NeuView do sterowania miniskopem i rejestrowania obrazów Ca²⁺.
   1. Włącz oprogramowanie kamery behawioralnej (zobacz Tabela materiałów), aby wyświetlić arenę zachowania myszy za pomocą funkcji Livestream. Ręcznie wyreguluj ostrość górnego aparatu (Rysunek 2L).
   2. Wybierz Trigger/Strobe i zaznacz "Włącz/wyłącz wyzwalacz" (Rysunek 3B). Kliknij przycisk Nagraj , użyj Przeglądaj , aby wybrać lokalizację, w której będą zapisywane nagrania zachowań, a następnie wybierz żądany format obrazu.
      UWAGA: Funkcja "Trigger Control" jest włączona, aby umożliwić wyzwalanie rejestracji zachowania przez oprogramowanie NeuView, tak aby ramki zachowania i odpowiadające im ramki obrazowania wapnia były czasowo sprzężone ze sobą. Nagranie zachowania można zapisać w dowolnym formacie. Zapis zachowania jest zazwyczaj zapisywany w formacie JPEG w wyznaczonym folderze.
   3. Zbliż mysz do areny i podłącz miniskop do kabla podłączonego do Systemu Akwizycji Danych (Rysunek 2L) (patrz Tabela materiałów). Mysz jest następnie umieszczana na środku areny.
   4. Dzięki funkcji Livestream w oprogramowaniu NeuView dostosuj moc diody LED, aby zoptymalizować jasność obrazu wapniowego.
      UWAGA: W przypadku obrazowania wapniowego szybkość nagrywania wynosi domyślnie 10 klatek/s.
   5. W NeuView odznacz LED1, kliknij Capture, , a następnie Trigger przyciski, aby rozpocząć nagrywanie, a następnie naciśnij Stop po 100 klatek.
      UWAGA: Ma to na celu nagranie obrazów tła dla około 100 klatek przy wyłączonych światłach LED.
   6. W oprogramowaniu kamery behawioralnej kliknij Rozpocznij nagrywanie (Rysunek 3C). W NeuView zaznacz LED1, kliknij na Capture, a następnie Trigger przyciski, aby rozpocząć nagrywanie. Naciśnij Zatrzymaj po 3000 klatek.
      UWAGA: Ma to na celu jednoczesne rejestrowanie obrazowania wapnia i jego zachowania. Test w terenie otwartym trwa 15 minut, zwykle jest podzielony na trzy sesje nagraniowe po 5 minut, z których każda trwa 5 minut. Ma to na celu zapobieżenie przegrzaniu miniskopu w wyniku ciągłego użytkowania.
   7. Zapisz zarówno obrazowanie wapnia, jak i nagrania zachowania w wyznaczonych folderach. Powtórz nagrywanie przez dwie kolejne sesje, nagrywając tło przed każdą sesją i zapisz wszystkie nagrania w wyznaczonym folderze.

Wyniki

Rysunek 1: Schematyczny przegląd procedury doświadczalnej. (A) Stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa do mPFC (przyśrodkowej kory przedczołowej). (B) Implantacja soczewki GRIN (soczewka gradientowo-indeksowa) w...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Aceton	Sigma-Aldrich	179124-1L	GRIN środek do czyszczenia soczewek
Behavior Recoding Software (Point Grey FlyCap2)	Point Grey	Point Grey Research Blackfly BFLY-PGE-12A2C	Do rejestrowania zachowania
Akwizycja danych kontroler	NIDA/IRP	Specjalnie zaprojektowany	Komponent systemu akwizycji obrazu
Kabel do transmisji danych	NIDA/IRP	Specjalnie zaprojektowany	Element systemu akwizycji obrazu
Soczewka GRIN	GRINTECH	NEM-100-25-10-860-S	Do implantacji soczewek GRIN
Podstawa miniskopu	Protolabs	Specjalnie zaprojektowana	Do montażu podstawy
Miniscope ramię trzymające	NIDA/IRP	Zaprojektowane na zamówienie	Do montażu podstawy
Nasadka ochronna miniskopu	Protolabs	Specjalnie zaprojektowane	Do ochrony miniskopu
Sterownik z napędem	Thorlabs	KMTS50E	Do montażu podstawy
NeuView	NIDA/IRP	https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0	Do obrazowania in vivo
Maść okulistyczna	Puralube Vet Maść	NDC 17033-211-38	Okulistyczna
taśma z politetrafluoroetylenu (PTFE)	TegaSeal Taśma PTFE	A-A-58092	Do mocowania miniLunety do podstawy
Sterylny wacik bawełniany	Puritan	REF 806-WC	Do obu operacji