$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Konfiguracja mikroskopu do obrazowania poklatkowego
1. Określanie ustawień lasera
1. Określanie długości fali lasera do użycia. Użyj długości fali, która jest dwukrotnie większa od długości fali wzbudzenia fluoroforu będącego przedmiotem zainteresowania (np. długość fali od 880 do 940 nm dla białka zielonej fluorescencji (GFP).
UWAGA: W niniejszym badaniu ustawienie długości fali dla GFP wynosiło od 880 do 940 nm. Im wyższa długość fali, tym mniejsza moc wyjściowa lasera.
2. Określ transmisję laserową. Wysoki procent transmisji laserowej zabije zarodek, użyj najniższego poziomu transmisji (zalecane). W przypadku badań poklatkowych trwających od 24 do 48 godzin, jak przedstawiono w niniejszym dokumencie, należy utrzymać transmisję poniżej 5%.
3. Określ systemy wykrywania mikroskopu i upewnij się, że odpowiednie filtry dla fluoroforu są na miejscu.
UWAGA: Dla mikroskopów wielofotonowych istnieje wiele systemów detekcji o różnej czułości na emitowaną fluorescencję. Ogólnie rzecz biorąc, wewnętrzny system wykrywania ma mniejszą czułość niż zewnętrzny system wykrywania. W przypadku linii transgenicznych o wysokim poziomie ekspresji GFP wewnętrzny system wykrywania jest odpowiedni. W przypadku linii transgenicznych o niskim poziomie ekspresji GFP lub z innymi fluoroforami (np. białkiem czerwonej fluorescencji) może być wymagany zewnętrzny system detekcji w celu utrzymania procentu transmisji laserowej na rozsądnym poziomie. Niezależnie od zastosowanego systemu detekcji, muszą być zainstalowane odpowiednie filtry dla fluoroforu.
2. Dostosowywanie ustawień oprogramowania w mikroskopie wielofotonowym
1. Korzystając z obiektywu 5X, zlokalizuj zarodek. Ręcznie podnieś stolik do najwyższej pozycji i użyj precyzyjnej ostrości, aby ustawić zarodek w środku zakresu mikroskopu.
2. Ręcznie obniż stolik i zmień obiektyw 5X na obiektyw 25X zanurzenie w wodzie (apertura numeryczna NA, 0.95). Ostrożnie podnieś scenę, aby zarodek ponownie był ostry.
3. W oprogramowaniu kliknij na tryb "xyzt", aby uzyskać wiele obrazów w odstępach czasu (t) w płaszczyźnie x-y na głębokości "z". Użyj widoku epifluorescencji lub jasnego pola, aby znaleźć głębię ostrości w obszarze zainteresowania, który wyznaczy stos Z.
1. W oprogramowaniu kliknij przycisk "rozpocznij"; w tych eksperymentach boczna krawędź oka była początkiem stosu Z. Kliknij przycisk "koniec"; linia środkowa zarodka była końcem stosu Z.
UWAGA: Rozmiar kroku wynosił 0,3-0,6 μm i było w sumie ~200 kroków dla rozmiaru stosu z od 60 do 120 μm).
4. Kliknij menu, aby dostosować czas akwizycji i częstotliwość obrazowania.
Dla obecnego systemu, ~200 kroków wymaga około 5 minut na każdą akwizycję z-stack. Aby zapewnić odpowiednią regenerację fluoroforu i przeżycie zarodka, należy uwzględnić stosunek co najmniej 1:3 między akwizycją z-stack (moc lasera włączona) a czasem regeneracji (wyłączenie lasera).
UWAGA: Na przykład z-stacki są pozyskiwane co 20 minut z 5 minutami akwizycji z-stack i 15 minutami odzyskiwania. W przypadku tego protokołu można uzyskać większe stosy z, ale odpowiednio wydłużyłoby to czas między akwizycjami stosu z, co skutkowałoby mniejszą liczbą obrazów w trakcie poklatkowym.
1. Mając odpowiedni czas na regenerację zarodków, ustaw czas między stosami z w wyznaczonym oknie. Ustaw łączny czas trwania eksperymentu w odpowiednim oknie.
5. Końcowe korekty oprogramowania, lasera i zarodków.
1. Włącz ustawienia obrazu na żywo, aby dokonać ostatecznych korekt ustawień lasera. Dostosuj suwaki transmisji laserowej, wzmocnienia i przesunięcia w oprogramowaniu, aby zoptymalizować obraz fluorescencyjny. W razie potrzeby dostosuj również orientację zarodka, w zależności od długości eksperymentu, przewidywanego wzrostu zarodka itp. Upewnij się, że obszar zainteresowania pozostaje w kadrze przez cały czas trwania eksperymentu.
2. Wyłącz epifluorescencyjne źródło światła, ponieważ nie jest ono już potrzebne podczas akwizycji poklatkowej. Przykryj stolik laserową skrzynką bezpieczeństwa (Rysunek 1I). W przypadku korzystania z wewnętrznego systemu detekcji laserowa skrzynka bezpieczeństwa jest wystarczająca do ochrony przed światłem tła. Naciśnij "start".
UWAGA: Jednak w przypadku bardziej czułych zewnętrznych systemów detekcji laserowa skrzynka bezpieczeństwa nie blokuje wystarczającej ilości światła tła i wymagane są dodatkowe osłony, aby zapobiec zakłóceniom akwizycji obrazu.
2. Podczas akwizycji poklatkowej
1. Napełniaj otwartą komorę kąpieli pożywką poklatkową z zarodkami co 8-12 godzin (co najmniej 2 razy dziennie) podczas akwizycji poklatkowej przez przesuwane drzwi w laserowej skrzynce bezpieczeństwa (Rysunek 1I).
2. Przed otwarciem drzwiczek laserowego bezpiecznika upewnij się, że mikroskop nie rejestruje aktywnie obrazu.
UWAGA: Użycie grzałek i systemów z mediami obiegowymi nie jest konieczne w przypadku eksperymentów z obrazowaniem poklatkowym trwających od 24 do 48 godzin. Rzeczywiście, temperatury zarówno podgrzewaczy etapowych, jak i liniowych są trudne do kontrolowania, a podczas akwizycji obrazu zarodek wykazuje odpowiednie tempo rozwoju w zakresie temperatur od 25 do 28 °C. Co więcej, systemy mediów obiegowych mają tendencję do przepełniania się i potencjalnego uszkodzenia sprzętu. W związku z tym wszystkie zarodki są rutynowo inscenizowane po nabyciu.
3. Przetwarzanie po przejęciu
1. W oprogramowaniu kliknij menu "plik" i wybierz "zapisz".
2. Otwórz plik w oprogramowaniu do przetwarzania obrazów (zobacz Tabelę materiałów). Wyróżnij właściwą serię obrazów. W oprogramowaniu wybierz menu "Proces". Kliknij Dekonwolucja 3D i "Zastosuj", aby zdekonwolucjonizować każdy stos z.
UWAGA: Plik jest duży; Dlatego ten krok może zająć wiele godzin.
3. W oprogramowaniu, w menu "Proces", kliknij "maksymalna projekcja". Kliknij "Zastosuj", aby zainicjować maksymalną projekcję w celu wygenerowania 1 obrazu na stos z. Eksportuj każdy maksymalny rzutowany plik (1 obraz na stos z) jako tiff.
4. Importuj indywidualne pliki tiff do oprogramowania do przetwarzania wideo. Zaznacz wszystkie pliki tiff i przeciągnij je do edytora wideo. Dostosuj długość każdego obrazu w filmie do 0,1 s. Eksportuj wideo jako plik mov lub mp4.
