Wizualizacja wzorców projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila

Streszczenie

Źródło: Jeong, S. Wizualizacja wzorca projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film pokazuje wizualizację projekcji aksonalnych w zarodkach Drosophila. Znakowanie immunologiczne neuronów ruchowych, precyzyjna sekcja w celu odsłonięcia struktur neuronalnych oraz mikroskopia kontrastowa z różnicową interferencją łącznie ujawniają szczegółową architekturę neuronów, podkreślając wzorce projekcji aksonalnej.

Protokół

1. Przygotowanie

1. Przygotować 500 ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) z roztworem t-oktylofenoksyetoksyetanolu (PBT), dodając 0,5 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 0,5 ml t-oktylofenoksypolietylenu (patrz tabela materiałów) do 500 ml 1X PBS i mieszając przez co najmniej 30 min. Przechowywać w temperaturze 4 °C. Stosować w miarę świeży roztwór i przechowywać go w czystej butelce.
2. Przygotuj 10 ml 4% paraformaldehydu, dodając 2,5 ml 16% podstawowego roztworu paraformaldehydu i 1 ml 10x PBS do 6,5 ml wody dejonizowanej. Przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu tygodnia.
   UWAGA: Unikaj kontaktu skóry z roztworem paraformaldehydu, ponieważ jest on wysoce toksyczny.
3. Otrzymać substrat 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-galaktopiranozydu (X-Gal) (10% w/v X-Gal w dimetylosulfotlenku (DMSO)) przez rozpuszczenie 0,1 g substratu X-Gal na 1 ml DMSO. Przechowywać w temperaturze -20 °C w 100 μl porcji.
4. Przygotować roztwór barwiący X-Gal przy użyciu 10 mM buforu fosforanowego (pH 7,2), 150 mM chlorku sodu, NaCl, 1 mM chlorku magnezu, MgCl₂, 3 mM żelazocyjanku potasu, K₄[FeII(CN)₆], 3 mM żelazocyjanek potasu, K₃[FeIII(CN)₆], i 0,3% t-oktylofenoksypolietylenu. Przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności.
5. Przygotuj 3% roztwór nadtlenku wodoru, rozcieńczając 30% nadtlenku wodoru w stosunku 1:10 wodą dejonizowaną.
6. Przygotować roztwór 3,3′-diaminobenzydyny (DAB), całkowicie rozpuszczając 1 tabletkę (10 mg) DAB w 35 ml świeżego roztworu PBT. Przefiltrować przez filtr strzykawkowy 0,2 μm i przechowywać w temperaturze -20 °C w porcjach o pojemności 910 μl.
   UWAGA: Wyrzuć wszystkie odpady DAB do wybielacza, aby zniszczyć DAB.
7. Zrób talerze jajkowe z sokiem jabłkowym. Dodać 35 g agaru i 1 l wody dejonizowanej do kolby o pojemności 2 l. Do kolby o pojemności 1 l dodać 33 g sacharozy, 2 g tegoseptu i 375 ml soku jabłkowego. Rozpuść je w autoklawie przez 30 minut. Pozostawić oba roztwory do ostygnięcia do temperatury około 60 °C. Połączyć i dobrze wymieszać te roztwory, mieszając. Wlać ~11 ml połączonego roztworu na 60 mm naczynie hodowlane.
8. Przygotuj pastę drożdżową, mieszając drożdże piekarskie z wodą dejonizowaną (w stosunku 1:0,8) i przechowuj w temperaturze 4 °C.

2. Pobieranie zarodków (dzień 1)

1. Zbierz młode samice i samce much (młodsze niż 5 dni) i przez 1-2 dni trzymaj je w plastikowej klatce ze zlewką z talerzem jajowym (60 mm x 15 mm), który zawiera niewielką ilość pasty drożdżowej w środku.
2. Aby uzyskać optymalne pobranie zarodków w późnym stadium 16, około godziny 17:00 należy ustawić koszyk na bidon z muchami (> 50) i pozwolić im złożyć jaja w temperaturze 25 °C przez 3 godziny.
3. Przenieś muchy do butelki ze świeżym jedzeniem.
4. Zamknij talerz jaj pokrywką i inkubuj go do góry nogami w temperaturze 25 °C w nawilżanym inkubatorze (~70% wilgotności) przez noc.

3. Przygotowanie zarodków do barwienia immunologicznego (dzień 2)

1. Dodaj 1,8 ml roztworu PBT do płytki jajowej około godziny 10:20 i użyj bawełnianego wacika, aby poluzować zarodki z płytki, przechylając ją.
   UWAGA: Delikatnie rozgniatając pastę drożdżową za pomocą bawełnianego wacika, rozpuść ją w przypadku, gdy znajdzie się na niej duża liczba zarodków. Rozpocznij pobieranie zarodków ~40 minut przed fiksacją (około godziny 11:00).
2. Przenieś zarodki z płytki jajowej do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 ml.
3. Pozwól zarodkom się uspokoić i odessać roztwór PBT tak bardzo, jak to możliwe. Przepłukać zarodki dwukrotnie 1 ml roztworu PBT. Zasysać roztwór PBT tak bardzo, jak to możliwe.
4. Napełnij probówkę 1 ml 50% wybielacza (i.e. rozcieńczonego w wodzie dejonizowanej) i dechorionuj zarodki, inkubując je na nutatorze przez 3 minuty w temperaturze pokojowej (RT).
   UWAGA: Ten krok nie zabija zarodków z dekorionacją.
5. Pozwól zarodkom z odciętą kosmówką się uspokoić, odessaj 50% wybielacza tak bardzo, jak to możliwe, i przepłucz zarodki 3 razy 1 ml roztworu PBT.
6. Dodać 0,5 ml heptanu, a następnie dodać 0,5 ml 4% roztworu paraformaldehydu do probówki w temperaturze pokojowej około godziny 11:00.
7. Inkubuj zarodki na nutatorze przez 15 minut w temperaturze RT.
8. Usuń 4% roztwór paraformaldehydu (dolna warstwa).
9. Dodaj 0,5 ml 100% metanolu i zdewitelinuj zarodki, energicznie potrząsając probówką przez 30 sekund.
10. Usuń heptan (tj. górna warstwa).
11. Dodaj 0,5 ml 100% metanolu i energicznie potrząsaj probówką przez 10 s.
12. Pozwól zarodkom się uspokoić, stukając w probówkę i odessaj metanol tak bardzo, jak to możliwe. Opłucz zarodki 1 ml 100% metanolu, wstrząsając przez mniej niż 10 sekund.
    UWAGA: Przedłużona ekspozycja na metanol niszczy aktywność β-Gal.
13. Usunąć metanol i przepłukać zdewitynizowane zarodki 3 razy 1 ml roztworu PBT.

4. Genotypowanie zarodków za pomocą barwienia LacZ (dzień 2)

1. Dodaj 1 ml roztworu PBT do probówki i inkubuj probówkę w bloku grzewczym o temperaturze 37 °C lub łaźni wodnej przez 15 minut.
2. Podczas inkubacji umieść roztwór barwiący X-Gal (1 ml na probówkę) w temperaturze 65 °C w łaźni wodnej, aż stanie się mętny. Inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
3. Odessać roztwór PBT i dodać do probówki 1 ml roztworu barwiącego X-Gal i 20 μl podłoża X-Gal.
4. Inkubować probówkę w temperaturze 37 °C z nutacją, aż do uzyskania widocznego niebieskiego osadu.
   UWAGA: Czas inkubacji dla 2. i 3. niebieskiego balansera na ogół wynosi od 2 do 4 godzin.
5. Usuń roztwór barwiący X-Gal i przepłucz zarodki 3 razy 1 ml roztworu RT PBT.
6. Za pomocą sondy igłowej lub kleszczyków ręcznie posortuj zarodki o pożądanym genotypie (, tj. niebarwione białe zarodki) za pomocą lekkiego mikroskopu preparacyjnego (obiektywy 1,6X-2,5X).
   UWAGA: Ponieważ niektóre niebieskie równoważniki, takie jak CyO, aktyna-LacZ i TM3, aktyna-LacZ, przenoszą transgeniczny konstrukt eksprymujący bakteryjny β-Gal (LacZ) pod kontrolą promotora aktyny, zarodki barwione na niebiesko w wszechobecny sposób zawierają jedną lub dwie kopie chromosomów niebieskiego balansera. Dlatego niebarwione białe zarodki są homozygotyczne pod względem pożądanego allelu letalnego.

5. Barwienie immunologiczne zarodków przeciwciałami antyfaszylinowymi II (dzień 2-3)

1. Zbierz i przenieś zarodki o pożądanym genotypie (tj. niebarwione białe zarodki) do mikroprobówki o pojemności 0,5 ml za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml.
   UWAGA: Na tym etapie, zarodki mogą być z grubsza klasyfikowane zgodnie z kryteriami morfologicznymi, w tym wzorcami segmentacji naskórka oraz strukturami głowy i ogona. Podczas inwolucji głowy, między 10 a 16 godziną po złożeniu jaj, zarodek ulega wyraźnemu zmniejszeniu przedniego odcinka.
2. Umyj zarodki raz 0,4 ml roztworu PBT i dodaj 0,3 ml roztworu blokującego (5% normalnej surowicy koziej i 5% DMSO w roztworze PBT).
3. Zablokuj zarodki za pomocą nutacji w RT przez 15 minut.
4. Dodać 75 μl przeciwciała anty-Fasciclin II i inkubować probówkę z nutacją w RT przez noc.
5. Umyj zarodki 4 razy 0,4 ml roztworu PBT przez co najmniej 20 minut na przemycie.
6. Dodać 0,3 ml roztworu blokującego (5% normalnej surowicy koziej w roztworze PBT) zawierającego kozie przeciwciało przeciwko mysiej peroksydazie chrzanowej (anty-mysie-HRP) (2 μg/ml) i inkubować probówkę z nutacją w temperaturze pokojowej przez noc.
7. Umyj zarodki 6 razy 0,4 ml roztworu PBT przez co najmniej 20 minut na płukanie.
8. Dodać 0,3 ml roztworu DAB do probówki.
   UWAGA: Załóż rękawice i umieść wszystkie odpady/tubki/końcówki DAB w wybielaczu.
9. Dodać 2 μl 3% nadtlenku wodoru i inkubować probówkę w ciemności z nutacją w temperaturze pokojowej, aż do wytworzenia pożądanej ilości osadu.
   UWAGA: Czas inkubacji immunohistochemii 1D4 ogólnie waha się od 0,5-1 h.
10. Umyj zarodki 4 razy 0,4 ml roztworu PBT.
    UWAGA: Usuń roztwór DAB i pierwsze dwa mycia pipetą i wyrzuć je do wybielacza.
11. Dodaj 0,2 ml 70% roztworu glicerolu/PBS do probówki i przechowuj w temperaturze pokojowej lub 4 °C.
    UWAGA: Trzymaj probówkę z dala od światła. Bardziej klarowne preparaty można uzyskać, umieszczając zarodki w 90% roztworze glicerolu/PBS. Jednak trudniej jest przeprowadzić sekcję zarodków oczyszczonych w 90% roztworze glicerolu/PBS niż tych oczyszczonych w 70% roztworze glicerolu/PBS.

6. Inscenizacja, preparacja, montaż i obrazowanie zarodków (dzień 4)

1. W celu oceny stopnia zaawansowania przenieś zarodki zrównoważone 70% glicerolem/PBS na szklane szkiełko.
2. Zbierz zarodki w późnym stadium 16, które mają nerwy nerwów międzysegmentowych 7 (A7), A8 i A9 (ISN) zbiegające się, aby się ze sobą stykać lub / i mają jelito środkowe podzielone na trzy pasma.
   UWAGA: Zarodki barwione przeciwciałem 1D4 mogą być klasyfikowane na podstawie wzorców projekcji aksonów motorycznych ISN i ISNb. Po wyjściu z ośrodkowego układu nerwowego (OUN), nerwy A7, A8 i A9 ISN zarodków w późnym stadium 16 zbiegają się, aby się stykać, a następnie rozchodzą się, aby rozszerzyć się daleko do mięśni grzbietowych (grot strzałki w Rysunek 1A). Jednak w zarodkach w środkowym stadium 16 nerwy ISN A7 rozciągają się równolegle z nerwami A8/A9 (nawias kwadratowy w Rysunek 1B). Ponadto osie projekcyjne nerwów A6 ISNb (prostopadłych do mięśni brzuszno-bocznych) w obu półsegmentach są z grubsza wyrównane z tylnym końcem pęczków aksonów podłużnych OUN (strzałki i linia w Rysunek 1C). Te kryteria morfologiczne różnią się w zależności od genotypu. Alternatywnie, zarodki mogą być klasyfikowane na podstawie morfologii jelit. Przed etapem 17 jelito środkowe ma kształt przypominający serce, podczas gdy jelito środkowe jest podzielone na trzy pasma w stadium 17.
3. Wypreparuj zarodki.
   1. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml wyjmij każdy zarodek z kropli glicerolu i umieść zarodek brzusznie do góry. Odetnij przednią część na 1/4 długości ciała i najbardziej tylny obszar, który jest wolny od aksonów motorycznych.
   2. Za pomocą sondy igłowej wyjmij odcięty na końcu zarodek z kropli glicerolu, zwiń go, aby ustawić go grzbietowo do góry i umieść poziomo na polu.
      UWAGA: Kiedy zarodek jest usuwany z kropli glicerolu, odrobina glicerolu związanego z zarodkiem sprawia, że staje się on lepki.
   3. Przeciąć zarodek wzdłuż grzbietowej linii środkowej za pomocą pojedynczej, bardzo cienkiej igły wolframowej. Wykonaj małe nacięcie na tylnym końcu zarodka, a następnie kontynuuj cięcie grzbietowej linii środkowej w kierunku przedniej; Cięcie w przeciwnym kierunku jest również w porządku.
   4. Za pomocą sondy igłowej przenieś zarodek przecięty w linii środkowej do kropli glicerolu, umieść go grzbietem do góry i odłącz jelito od ściany ciała, rozkładając każdą ścianę ciała w kierunku brzuszno-bocznym (ukośnym) (obiektyw 2,5x).
      UWAGA: Upewnij się, że grzbietowa linia środkowa jest całkowicie przecięta, co spowoduje całkowite oddzielenie lewej i prawej ściany ciała.
   5. Ostrożnie wysuń zarodek wycięty w linii środkowej z kropli glicerolu, a następnie połóż dwa płaty ściany ciała na szkiełku podstawowym za pomocą sondy cienkoigłowej (obiektyw 2,5x).
   6. Za pomocą bardzo cienkiej igły wolframowej usuń narządy wewnętrzne z wypreparowanego zarodka, popychając je na boki (obiektyw 5X).
      UWAGA: Bardziej szczegółowy opis innej podobnej procedury preparacji można znaleźć na stronie internetowej.
4. Do montażu dodaj 2-3 μl 70% roztworu glicerolu/PBS do czystych, wypreparowanych zarodków i za pomocą sondy cienkoigłowej przenieś je na nowe szkiełko podstawowe, na którym rozprowadzono 8 μl 70% roztworu glicerolu/PBS w środku (obiektyw 2,5X).
5. Założyć szkiełko nakrywkowe (18 mm x 18 mm). Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego zwykłym lakierem do paznokci (przezroczystym lub kolorowym jest w porządku).
6. Rejestruj obrazy w wysokiej rozdzielczości (obiektywy zanurzone w oleju 20X, 40X i 63X) pod mikroskopem świetlnym z kontrastem interferencyjnym (DIC), zgodnie z instrukcjami producenta.
   UWAGA: Lepsza wizualizacja i charakterystyka fenotypowa, szczególnie dla aksonów motorycznych ISNb, może być uzyskana przy użyciu obiektywu 63X z zanurzeniem w olejku.

Wyniki

Rycina 1: Ocena zarodków na podstawie wzorców projekcji aksonów motorycznych ISN i ISNb. (A) W późnym stadium 16 zarodków typu dzikiego, nerwy ISN A7, A8 i A9 (strzałki) zbiegają się, aby się stykać (grot strzałki). Przednia jest lewa, a ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma-Aldrich	A7906
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	t-oktylofenoksyetoksyetanol
16% roztwór paraformaldehydu	Ted Pella	18505
Chlorek sodu	Sigma-Aldrich	S5886
Chlorek potasu	Sigma-Aldrich	P5405
Fosforan sodu dwuzasadowy	Sigma-Aldrich	30435
Fosforan sodu jednozasadowy	Sigma-Aldrich	71500
Podłoże X-Gal	US Biological	X1000	X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galaktozyd galaktopiranozyd)
Dimetylosulfotlenek	Sigma-Aldrich	D4540
Chlorek magnezu	Sigma-Aldrich	M8266
Trójwodzian heksacyjanożelazianu(II) potasu	Sigma-Aldrich	P9387
Heksacyjanożelazian(III)	Sigma-Aldrich	244023
Nadtlenek wodoru	Sigma-Aldrich	216763
Tetrachlorowodorek 3,3'-diaminobenzydyny	Sigma-Aldrich	D5905
Agar	US Biological	A0930
Sacharoza	Fisher Scientific	S5-3
Tegosept (4-hydroksybenzoesan metylu)	Sigma-Aldrich	H5501
Naczynie hodowlane (60 mm)		Zlewka Corning
Tricon	Simport	B700-100	Służy do wykonania plastikowej klatki zlewki do pobierania zarodków.
Drożdże	Société Industrielle Lesaffre	Saf Instant Yeast Red
Wacik bawełniany (drewniana bawełna z pojedynczą końcówką PK100)	VWR	14220-263
Tubka Eppendorf (1,5 ml)	Sarstedt	#72.690
Wybielacz	The Clorox Company	Clorox
Heptane	Sigma-Aldrich	246654
Metanol	J.T. Baker	UN1230
Normalna surowica kozia	Technologies	16210-064
Przeciwciało anty-FasciculinII	Badania rozwojowe Hybridoma Bank	1D4 anty-Fasciclin II
Kozia przeciwciało anty-mysie-HRP	Jackson Immunoresearch	115-006-068	AffiniPure F(ab')2 fragment kozy anty-mysi IgG+IgM (H+L)(min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Szkło ślizgowe	Duran Group	235501403
Szkiełko nakrywkowe	Duran Group	235503104	18 x 18 mm
1 ml Strzykawka	Becton Dickinson Medical(s)	301321
Igła wolframowa	Ted Pella	#27-11	Drut wolframowy, ø0.13mm/6.1m (ø.005"/ 20 stóp)
Nutator (Mini twister)	Koreańska nauka	KO. VS-96TWS	Alternatywnie, nutator marki BD clay Adams (BD 421125)

430166 Life