Obrazowanie in vivo mózgu larw danio pręgowanego w celu wizualizacji neuronów móżdżku

Źródło: Schramm, P. et al. Obrazowanie in vivo w pełni aktywnej tkanki mózgowej u wybudzonych larw danio pręgowanego i osobników młodocianych poprzez usunięcie czaszki i skóry. J. Vis. Exp. (2021)

Ten film pokazuje obrazowanie in vivo neuronów móżdżku u transgenicznych larw danio pręgowanego, które wyrażają białka fluorescencyjne w neuronach Purkinjego. Proces polega na znieczuleniu larw, unieruchomieniu ich w agarozie i ostrożnym usunięciu pigmentowanej skóry w celu zwiększenia penetracji światła i intensywności fluorescencji. Na koniec przygotowane próbki są obrazowane pod mikroskopem konfokalnym, aby wyraźnie uwidocznić oznakowane neurony.

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

Znieczulenie larw i preparaty do osadzania
1. Rozpoczynając eksperyment na dany dzień, przenieś potrzebne zwierzęta za pomocą plastikowej pipety Pasteura na szalkę Petriego o średnicy 90 mm, która jest wypełniona albo Danieau (dla larw, które są nadal trzymane na szalce Petriego z Danieau), albo wodą z obiektu dla ryb (dla larw, które są starsze niż 7 dni po zapłodnieniu [dpf] i są trzymane w obiekcie rybackim).
  1. Podczas pipetowania ryb starszych niż 2 tygodnie, upewnij się, że otwór pipety jest wystarczająco duży, aby uniknąć zranienia ryby podczas ich przenoszenia. Nie używaj sieci, ponieważ fizycznie uszkodzi to ryby, zwłaszcza młodsze larwy.
2. Dodać nauplia z wrotka lub artemii dostosowane do wielkości larw trzymanych na szalce Petriego, aby zapewnić swobodny dostęp do pożywienia i maksymalny stan zdrowia larw oraz zmniejszyć stres.
3. W celu osadzenia przenieś wybrane larwy na szalkę Petriego o średnicy 35 mm wypełnioną sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (ACSF). Dodać niezbędną objętość d-tubokuraryny, aby osiągnąć stężenie robocze/skuteczną dawkę 10 μM i odczekać kilka minut, aż larwy zostaną całkowicie unieruchomione.
  UWAGA: Gdy ryby dorosną lub jeśli potrzebne jest szybsze pełne znieczulenie (poniżej 5 minut), możliwe jest zwiększenie stężenia d-tubokuraryny (LD50 dla myszy wynosi 0,13 mg/kg dożylnie). Możliwe jest również zastosowanie innego środka znieczulającego, takiego jak α-bungarotoksyna (stężenie robocze: 1 mg/ml), który ma taki sam efekt jak kurara i również utrzymuje mózg w pełni aktywny. Jeśli w pełni aktywny mózg nie jest konieczny dla badanego obiektu, trikaina w dawce nieśmiertelnej (0,02%) jest również opcją pełnego znieczulenia larw. Jednak trikaina blokuje kanały sodowe, upośledzając w ten sposób aktywność mózgu.
4. Przygotuj komorę montażową, biorąc pokrywkę szalki Petriego o średnicy 35 mm, odwróć pokrywkę do góry nogami i umieść kwadratowe szklane szkiełko nakrywkowe (24 x 24 mm) na dnie pokrywki. Patrz rysunek 1 (górna część), aby zapoznać się ze schematycznym opisem tych kroków. Gładsza powierzchnia szkła zapobiega zsuwaniu się bloku agarozy, w którym znajdują się larwy podczas zabiegu otwierania czaszki.
5. Porcję ACSF potrzebną na dzień rozmieścić w odpowiedniej fiolce (np. probówce o pojemności 50 ml, zlewce, butelce Schotta itp.) i natlenić karbogenem (5% CO_{2 ,} 95 % O₂ ). Jeśli obrazowanie obejmuje tylko morfologię (np. wzorce fluorescencji), ACSF jest nadal konieczny, aby zapewnić integralność mózgu i aby komórki nie miały negatywnego wpływu na efekty osmolarności, ale natlenienie ACSF nie jest potrzebne. Ten krok należy wykonać tylko wtedy, gdy do obrazowania niezbędna jest pełna aktywność mózgu.
  UWAGA: Aby uzyskać optymalne nasycenie medium tlenem, dodaj kamień napowietrzający na końcu rurki karbogenicznej. Aby zagwarantować wystarczająco wysoki poziom tlenu, konieczna jest wymiana ACSF w komorach obrazowania na świeżo natleniony ACSF co 20-60 minut, w zależności od liczby i wieku larw osadzonych w tej samej komorze obrazowania (np. dla pojedynczej osadzonej larwy wystarczy wymiana ACSF co godzinę. Dla sześciu larw starszych niż 14 dpf osadzonych równolegle konieczna jest wymiana ACSF co 20 minut), więc zaplanuj niezbędną ilość ACSF nasyconego tlenem zgodnie z planowanym eksperymentem.
Osadzanie larw<ol style='list-style-type:decimal;'>
Przenieść w pełni znieczulone larwy za pomocą plastikowej pipety Pasteura do (w kroku 1.4) przygotowanej komory montażowej. Następnie ostrożnie usuń nadmiar pożywki, aby uniknąć rozcieńczenia agarozy o niskiej temperaturze topnienia (LM). Wszystkie poniższe czynności należy wykonać pod mikroskopem stereoskopowym o wystarczającym powiększeniu.
UWAGA: Przechylenie komory montażowej może pomóc w całkowitym usunięciu medium.
Przejdź natychmiast do następnego kroku, dodając wystarczająco dużą kroplę LM-agarozy na wierzch larw (około 1 ml, w zależności od wielkości larw), aby chronić zwierzęta przed wysuszeniem i zmniejszyć niepotrzebny stres.
Ustaw larwy w odpowiedniej pozycji, zanim agaroza zastygnie. Upewnij się, że grzbietowa część larw jest skierowana do góry. Upewnij się również, że larwy są osadzone jak najbliżej powierzchni agarozy.
UWAGA: W zależności od wielkości i liczby larw planowanych do zagnieżdżenia w tym samym czasie, możliwe jest dostosowanie stężenia agarozy. Na przykład dla 1-3 larw w wieku 30 dpf zalecane jest stężenie 1,8%-2% LM-agarozy. W przypadku 1-4 larw w wieku 7 dpf najpraktyczniejsze jest użycie 2,5% LM-agarozy, podczas gdy w przypadku 5-8 larw bardziej odpowiednie jest 2%. Jeśli wymagany jest w pełni aktywny mózg, zaleca się osadzenie tylko trzech ryb w tym samym czasie, aby skrócić czas potrzebny do operowania larwami. Ogólnie rzecz biorąc, zaleca się stosowanie niższych stężeń (1,8%-2%), im starsze są larwy lub im więcej larw planuje się zagnieździć w tym samym czasie.
Jeśli obrazy są rejestrowane za pomocą odwróconego mikroskopu, przytnij blok agarozy zawierający larwy do małego prostopadłościanu. Jest to ważne dla późniejszego przeniesienia larw do komory obrazowania. W przypadku korzystania z mikroskopu pionowego takie przycinanie nie jest konieczne, ponieważ komora montażowa może być również używana jako komora obrazowania. Na rysunku 1 (górna część) znajduje się schematyczny opis tych kroków.

Odsłanianie mózgu
UWAGA: Wszystkie poniższe czynności należy wykonywać z największą ostrożnością, aby niepotrzebnie nie uszkodzić larw. Jeśli do eksperymentu wymagany jest w pełni aktywny mózg, należy pamiętać, że z każdą mijającą sekundą, podczas gdy ryba jest nadal w pełni zamontowana w agarozie i ma otwartą czaszkę bez natlenionego ACSF, mózg będzie cierpiał z powodu braku tlenu i wyschnie. Skutki niedoboru tlenu staną się tym bardziej dramatyczne, im starsze są osadzone larwy. Dlatego ważne jest, aby wykonać operację nie tylko w jak najkrótszym czasie, ale także z maksymalną precyzją, aby uniknąć mechanicznego uszkodzenia mózgu za pomocą igły. Kroki 3.2-3.4 nie powinny trwać dłużej niż 30 s na rybę podczas treningu.

Rozpocznij operację, gdy tylko agaroza zastygnie. Najpierw odetnij cały nadmiar agarozy nad obszarem zainteresowania mózgu, aby uzyskać swobodny dostęp do głowy i wolną przestrzeń roboczą. Jeśli grzbietowa część głowy już wystaje z agarozy, pomiń ten krok.

W zależności od regionu zainteresowania wybierz miejsce, w którym rozpoczniesz operację. Weź szklaną igłę i wykonaj małe nacięcie przez skórę, nie wnikając zbyt głęboko w tkankę. Będzie to punkt wyjścia do odklejenia nakładającej się skóry.
UWAGA: Aby uzyskać optymalne wyniki, nigdy nie zaczynaj bezpośrednio nad obszarem zainteresowania, aby zmniejszyć ryzyko uszkodzenia ważnych struktur. W razie potrzeby można zacząć od tyłu do tyłomózgowia i pracować do przodu, aż niechciany obszar skóry zostanie złuszczony.

Kontynuuj z bardzo małymi nacięciami wzdłuż części skóry, dążąc do usunięcia, ledwo przesuwając igłę tuż pod powierzchnią. W większości przypadków nie jest konieczne całkowite poruszanie się po mózgu i wycinanie okrągłego kawałka skóry i czaszki, ale raczej wykonanie dwóch nacięć wzdłuż głowy, a następnie odepchnięcie skóry na jedną lub drugą stronę. Rycina 2 przedstawia schematyczne przedstawienie optymalnej strategii cięcia w celu uzyskania swobodnego dostępu do móżdżku.
UWAGA: Ta mikrochirurgia jest delikatną procedurą i najprawdopodobniej będzie wymagała pewnego treningu, aby idealnie usunąć skórę bez uszkodzenia leżącego poniżej mózgu. Zaleca się również znalezienie optymalnej strategii cięcia dla interesującego obszaru mózgu i trzymanie się jej przez cały czas trwania eksperymentu.

Natychmiast po usunięciu skóry ze wszystkich osadzonych larw, wlej (natleniony) ACSF na agarozę, aby zalać niechciane cząsteczki skóry i krew, utrzymać mózg w pełni aktywny i chronić go przed wysuszeniem.
UWAGA: Jeśli do eksperymentu potrzebny jest zdrowy mózg, zaleca się wybranie maksymalnie trzech ryb na raz.

Jeśli używasz mikroskopu pionowego, zacznij od razu od obrazowania.

Podczas korzystania z odwróconego mikroskopu, wsuń małą szpatułkę pod prostopadłościenny blok agarozy (krok 2.4).
Dodać niewielką kroplę LM-agarozy na dno komory obrazowania (np. naczynia ze szklanym dnem) i natychmiast obrócić blok agarozy zawierający larwy szpatułką pod kątem 180° i delikatnie docisnąć go do dna komory obrazowania, podczas gdy płynna kropla agarozy działa jak klej.
Gdy agaroza zastygnie, napełnij komorę obrazowania (natlenionym) ACSF, a następnie rozpocznij obrazowanie. Patrz rysunek 1 (dolna część) w celu zapoznania się z opisem schematu.

Gdy do eksperymentu wymagana jest pełna aktywność mózgu, zawsze upewnij się, że ACSF w komorze obrazowania ma wystarczająco wysoki poziom tlenu. Aby to zapewnić, pożywkę należy ostrożnie wymieniać ze świeżo natlenionym ACSF co 20-60 minut (w zależności od liczby i wielkości ryb, wielkości i powierzchni komory obrazowania oraz czasu trwania obrazowania).

Nazwa	Firma	Numer katalogowy
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy	Leica	TCS SP8
d-Tubocurare	Sigma-Aldrich	T2379-100MG
Kapilara szklana typ 1	WPI	1B150F-4
Szklana kapilara typ 2	Aparat Harvard	GC100F-10
Szkło Szkiełko nakrywkowe	deltalab	D102424
Komora obrazowania	Ibidi	81156
LM-Agaroza	Condalab	8050.55
Kamera mikroskopowa	Leica	DFC9000 GTC
Ściągacz igieł typ 1	NARISHIGE	Model PC-10
Ściągacz igieł typ 2	Instrumenty Sutter Model	P-2000
Pipety Pasteura 3ml	A.Hartenstein	20170718
Tricain	Sigma-Aldrich	E10521-50G
Szalka Petriego 35 mm	Sarstedt	833900
Szalka Petriego 90 mm	Sarstedt	821473001

Obrazowanie in vivo mózgu larw danio pręgowanego w celu wizualizacji neuronów móżdżku

W tym artykule

Streszczenie

Protokół

Wyniki

Materiały

Tagi