Charakterystyka właściwości mechanicznych tkanki mózgowej myszy za pomocą mikroskopii sił atomowych

Streszczenie

Źródło: Canovic, E. P., et al. Charakterystyka wieloskalowych właściwości mechanicznych tkanki mózgowej za pomocą mikroskopii sił atomowych, wgłębień udarowych i reometrii. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film pokazuje zastosowanie mikroskopii sił atomowych (AFM) do pomiaru właściwości lepkosprężystych tkanki mózgowej, w której wspornik ze sferyczną sondą oddziałuje z tkanką i ugina się pod wpływem przyłożonych sił. Wiązka laserowa skierowana na detektor śledzi wspornik w celu zmierzenia głębokości wgłębienia i relaksacji siły, co pozwala na scharakteryzowanie właściwości mechanicznych tkanki.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Wgłębienie z użyciem mikroskopu sił atomowych (AFM)

1. Przygotuj szalki Petriego (P60) o średnicy 60 mm z bioklejem pochodzącym z małży zgodnie z instrukcjami producenta.
   1. Przygotować zapas z obojętnego roztworu buforowego składającego się z 0,1 M wodorowęglanu sodu w sterylnej wodzie o optymalnym pH 8,0. Przefiltruj i wysterylizuj (0,2 mikrona) bufor wodorowęglanu sodu i przechowuj go w temperaturze 4 °C.
   2. W okapie z przepływem laminarnym wymieszaj roztwór 6,25% bioadhezji pochodzącej z małży i 3,125% wodorotlenku sodu (NaOH) w buforze wodorowęglanu sodu.
   3. Odpipetować 100 μl roztworu bioadhezji na szalkę Petriego (P60) o średnicy 60 mm i za pomocą końcówki pipety rozprowadzić roztwór w okręgu o średnicy 3-5 cm.
   4. Pozostaw szalki P60 odkryte w okapie z przepływem laminarnym i pozostaw roztwór do wyschnięcia (~30 min). Myć naczynia 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i 2x sterylną wodą. Pozostaw naczynia do wyschnięcia na powietrzu w okapie z przepływem laminarnym i przechowuj je w szczelnie zamkniętej plastikowej torbie w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
2. Skalibruj AFM i umieść próbkę mózgu w AFM. UWAGA: Postępuj zgodnie z instrukcjami kalibracji AFM według producenta.
   1. Ostrożnie załadować sondę AFM o nominalnej stałej sprężystości 0,03 N/m i koraliku borokrzemianowym o średnicy 20 μm do uchwytu sondy.
   2. Skalibruj stałą sprężystości i odwróconą czułość dźwigni optycznej (InvOLS) wspornika AFM za pomocą metody strojenia termicznego.
      UWAGA: Po obliczeniu stałej sprężystości dla sondy AFM, powinna ona pozostać stała przy wielokrotnym użyciu. Jednak wspornik InvOLS będzie musiał być ponownie kalibrowany za każdym razem, gdy laser jest ponownie ustawiany na wsporniku. Dodatkowo kalibrację należy przeprowadzić na podłożu o kilka rzędów wielkości sztywniejszym niż wspornik, takim jak polistyren.
   3. Włącz grzałkę zamontowaną na stoliku i ustaw temperaturę na 37 °C.
   4. Zamontuj plasterek mózgu na szalkach P60.
      1. Delikatnie wlej wycinek mózgu o grubości 350 μm i niezależne od dwutlenku węgla (CO₂) podłoże z kolby okrągłodennej do naczynia P60 pokrytego bioadhezją pochodzącą z małży.
      2. Umieść plasterek mózgu na środku naczynia P60, delikatnie go przechylając. Jeśli to konieczne, powoli odpipetuj pożywkę z pipety ręcznej, aby rozłożyć wycinek mózgu, który się złożył, lub jeszcze lepiej, umieść plasterek mózgu na środku naczynia.
      3. Ostrożnie usuń nadmiar podłoża za pomocą pipety P1000 (nie używaj odkurzacza).
      4. Umieść pokrywę na szalce P60 i pozwól plasterkowi mózgu przylegać przez 20 minut.
   5. Zdejmij głowę AFM, umieść wycinek mózgu zamontowany w naczyniu P60 na stoliku AFM i dodaj ~2 ml wstępnie podgrzanego CO₂-niezależne podłoże.
   6. Ostrożnie dodaj kroplę pożywki na sondę AFM, aby chronić ją przed pęknięciem z powodu napięcia powierzchniowego po opuszczeniu do podłoża otaczającego wycinek mózgu.
   7. Umieść głowicę AFM na stoliku i zacznij opuszczać głowicę, aż zostanie zanurzona w nośniku.
   8. Korzystając z kamery CCD (Charge-coupled device) z widokiem z góry, zmień położenie lasera na wsporniku.
      UWAGA: Ustawienie lasera na wsporniku zmieni się nieznacznie ze względu na różnicę w współczynniku załamania światła powietrza i medium.
   9. Odczekaj 5 minut, aż wspornik dostosuje się do zanurzenia w ciepłej cieczy, a następnie zresetuj ustawienie lustra do swobodnego odchylenia 0 V.
   10. Uruchom widmo termiczne na sondzie AFM zgodnie z instrukcjami producenta. Użyj pasowania pierwszego piku termicznego, aby ponownie obliczyć InvOLS sondy AFM w mediach.
   11. Za pomocą mikroskopu optycznego przesuń stolik próbki tak, aby obszar mózgu będący przedmiotem zainteresowania znajdował się poniżej sondy AFM. UWAGA: Ciało modzelowate będzie wyglądało na ciemne, ponieważ jest bardziej nieprzezroczyste niż otaczająca je istota szara. Kora jest lepsza od ciała modzelowatego.
   12. Zresetuj wyrównanie lustra do swobodnego odchylenia 0 V.
   13. Na mierniku sumy i ugięcia w oprogramowaniu AFM kliknij "Włącz", aby włączyć głowicę AFM.
   14. Za pomocą pokrętła pozycyjnego na głowicy AFM opuść głowicę, aż dojdzie do kontaktu między wspornikiem a próbką.
3. Przeprowadzanie eksperymentów z pełzaniem zgodności.
   1. Skonstruuj funkcję przyłożonej siły w edytorze funkcji oprogramowania. Funkcja siły składa się z 0,1-sekundowego narastania do zadanej wartości 5 nN i utrzymywania jej przez 20 sekund, a następnie 1-sekundowej rampy w dół do przyłożonej siły 0 nN.
      1. W panelu Wzorzec wcięć, w sekcji metody wcięcia, wybierz "Wczytaj" dla trybu wcięcia, "N" dla jednostek i "Edytor funkcji" dla funkcji wcięcia.
      2. W edytorze funkcji, w panelu Segment Parms, utwórz segment funkcji przyłożonej siły, który zaczyna się od 0 nN i kończy na 5 nN, z czasem 0,1 sekundy. Kliknij "Wstaw -->".
      3. W następnym segmencie ustaw początek na 5 nN, koniec na 5 nN, a czas na 20 sekund. Kliknij "Wstaw -->".
      4. Dla ostatniego segmentu ustaw początek na 5 nN, koniec na 0 nN, a czas na 1 sek. Następnie kliknij "Rysuj" i zamknij okno Edytora funkcji.
   2. Na karcie Siła w panelu głównym zaznacz "rampa wgłębnika po wyzwalaniu" i ustaw funkcję przyłożonej siły tak, aby uruchamiała się po osiągnięciu punktu wyzwalania 0,1 V.
   3. Kliknij "Pojedyncza siła" u dołu zakładki Siła w panelu głównym, co spowoduje wyzwolenie funkcji siły przyłożonej do konstrukcji w celu zapewnienia zgodności pełzania.
   4. Po zakończeniu wgłębienia z pojedynczą siłą należy podnieść głowicę AFM tak, aby nie stykała się z próbką. Następnie ponownie włącz głowicę i ponownie wyzeruj swobodne ugięcie.
   5. Zmień położenie stolika na próbki, aby zlokalizować nowy obszar zainteresowania i opuść głowicę AFM, aby nawiązać kontakt. UWAGA: Głowica AFM musi być cofnięta z powierzchni próbki, gdy stolik na próbkę jest przesuwany. Niezastosowanie się do tego może spowodować uszkodzenie delikatnego wspornika AFM.
   6. Powtarzaj kroki, aż zostanie zebrana żądana ilość danych.
4. Przeprowadzaj eksperymenty z relaksacją siły.
   1. Skonstruuj zastosowaną funkcję wcięcia w edytorze funkcji oprogramowania. Funkcja wcięcia składa się z 0,1-sekundowej rampy do zadanej wartości 3 μm i przytrzymania jej przez 20 sekund, a następnie 1-sekundowej rampy w dół do głębokości wcięcia 0 μm.
      1. Na panelu głównym wcięć, w ramach metody wcięcia, wybierz "Wcięcie" dla trybu wcięcia, "m" dla jednostek i "Edytor funkcji" dla funkcji wgłębnika.
      2. W edytorze funkcji, w panelu Segment Parms, utwórz segment funkcji przyłożonej siły, który zaczyna się od 0 μm i kończy na 3 μm, z czasem 0,1 sek. Kliknij "Wstaw -->".
      3. W następnym segmencie ustaw początek na 3 μm, koniec na 3 μm, a czas na 20 sekund. Kliknij "Wstaw -->".
      4. Dla ostatniego segmentu ustaw początek na 3 μm, koniec na 0 μm, a czas na 1 sek. Następnie kliknij "Rysuj" i zamknij okno Edytora funkcji.
   2. Na karcie Siła w Panelu głównym zaznacz "rampa wgłębnika po wyzwalaniu" i ustaw funkcję przyłożonej siły tak, aby wyzwalała się po osiągnięciu punktu wyzwalania 0,1 V.
   3. Kliknij "Pojedyncza siła" na dole zakładki Siła w Panelu głównym, aby uruchomić funkcję wcięcia zastosowanego w celu rozluźnienia siły.
   4. Po zakończeniu wgłębiania z pojedynczą siłą podnieś głowicę AFM tak, aby nie stykała się z próbką, a następnie ponownie włącz głowicę i ponownie wyzeruj ugięcie.
   5. Zmień położenie stolika, aby zlokalizować nowy obszar zainteresowania i opuść głowę, aby nawiązać kontakt.
   6. Powtarzaj oba pomiary, aż zostanie zebrana żądana ilość danych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Medium Hibernate-A	Gibco	A1247501	CO2-niezależne podłoże neuronowe dla tkanek dorosłych
Mikroskop sił atomowych, MFP-3D-BIO	Asylum Research	-
Podgrzewacz szalki Petriego	Badania nad azylem	-
Sonda AFM, sfera borokrzemianowa o promieniu 0,03 N/m, promień 10 μm	Novascan	PT.
Cell-Tak	Corning	354240	Bioadhezyjny klej na bazie małży
Wodorowęglan sodu	Sigma-Aldrich	S5761	Można stosować alternatywnych dostawców
Wodorotlenek sodu, 1N	Sigma-Aldrich	59223C	Można stosować alternatywnych dostawców

GS