Wieloparametryczne mapowanie optyczne serca królika z perfuzją Langendorffa

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje podstawowe procedury przeprowadzania eksperymentów mapowania optycznego w sercu królika z perfuzją Langendorffa przy użyciu systemu obrazowania panoramicznego oraz metody obrazowania dualnego (napięcie i wapń).

Streszczenie

Obrazowanie optyczne i sondy fluorescencyjne znacznie rozwinęły metodologię badań w dziedzinie elektrofizjologii serca w sposób, który nie mógłby być osiągnięty przez inne podejścia¹. Dzięki zastosowaniu barwników wrażliwych na wapń i napięcie, mapowanie optyczne umożliwia pomiar transbłonowych potencjałów czynnościowych i stanów przejściowych wapnia z wysoką rozdzielczością przestrzenną bez fizycznego kontaktu z tkanką. Dzięki temu pomiary aktywności elektrycznej serca są możliwe w wielu warunkach, w których użycie elektrod jest niewygodne lub niemożliwe¹. Na przykład zapisy optyczne zapewniają dokładne zmiany morfologiczne potencjału błonowego podczas i bezpośrednio po stymulacji i defibrylacji, podczas gdy konwencjonalne techniki elektrodowe cierpią z powodu artefaktów wywołanych bodźcem w trakcie i po bodźcach z powodu polaryzacji elektrod¹.

Serce królika z perfuzją Langendorffa jest jednym z najlepiej zbadanych modeli fizjologii i patofizjologii ludzkiego serca. Wiele rodzajów arytmii obserwowanych klinicznie można podsumować w modelu serca królika. Wykazano, że wzorce fal w sercu królika podczas arytmii komorowych, określone przez efektywną wielkość serca i długość fali powrotu, są bardzo podobne do tych w ludzkim sercu². Wykazano również, że krytyczne aspekty sprzężenia wzbudzenie-skurcz (EC) w mięśniu sercowym królika, takie jak względny udział retikulum sarkoplazmatycznego (SR), są bardzo podobne do sprzężenia EC³ u człowieka. W tym miejscu przedstawiamy podstawowe procedury eksperymentów mapowania optycznego w sercach królików z perfuzją Langendorffa, w tym konfigurację systemu perfuzji Langendorffa, konfigurację systemów mapowania optycznego, izolację i kaniulację serca, perfuzję i barwienie barwnikowe serca, rozprzęganie wzbudzenia-skurczu oraz zbieranie sygnałów optycznych. Metody te można również zastosować do serca u gatunków innych niż królik z dostosowaniem natężenia przepływu, optyki, roztworów itp.

Opisano dwa systemy mapowania optycznego. System mapowania panoramicznego służy do mapowania całego nasierdzia serca królika^4-7. System ten zapewnia globalny wgląd w ewolucję obwodów reentrantowych podczas arytmogenezy i defibrylacji oraz został wykorzystany do badania mechanizmów arytmii i terapii antyarytmicznej^8,9. System podwójnego mapowania służy do jednoczesnego mapowania potencjału czynnościowego (AP) i stanu przejściowego wapnia (CaT) z tego samego pola widzenia^10-13. Podejście to poszerzyło naszą wiedzę na temat ważnej roli wapnia w alternanach elektrycznych i indukcji arytmii^14-16.

Protokół

1. Przygotowanie

1. Przygotować świeżo przygotowany roztwór Tyrodesa (w mM, 128,2 NaCl, 1,3 CaCl₂, 4,7 KCl, 1,19 NaH₂PO₄, 1,05 MgCl₂, 20,0_NaHCO3 i 11,1 glukozy). Aby przyspieszyć codzienne przygotowywanie roztworów, należy wcześniej przygotować dwa roztwory podstawowe i przechowywać je w temperaturze +4°C w lodówce: (1) Stado I (w g/2L, 374,6 NaCl, 9,56 CaCl₂, 17,52 KCl, 8,21 NaH₂PO₄, 10,67 MgCl₂) i (2) Zapas II (w g/2L, 84,01 NaHCO₃). Aby 2 litry roztworu Tyrodesa były wystarczające do jednego eksperymentu, weź 1840 ml wody dejonizowanej i wymieszaj w niej 80 ml Bulionu I, 80 ml Bulionu II i 4 g glukozy.
2. Przygotować roztwory podstawowe barwników i rozłączaczy: (1) roztwór podstawowy blebbisatyny rozprzęgający wzbudzenie-skurcz (Tocris Bioscience, roztwór 2 mg/ml w DMSO); (2) wrażliwy na napięcie roztwór podstawowy barwnika di-4-ANEPPS (Invitrogen, 1 mg / ml roztwór w DMSO); (3) roztwór podstawowy barwnika wrażliwego na napięcie RH 237 (Invitrogen, roztwór 1,25 mg/ml w DMSO); (4) wskaźnik wapnia Rhod-2AM roztwór podstawowy (Invitrogen, 1 mg / ml roztwór w DMSO). Pojedynczy eksperyment na króliku wymaga około 30 μl roztworu podstawowego di-4-ANEPPS, 30 μl roztworu podstawowego RH237 i 200 μl roztworu podstawowego Rhod-2AM. Aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania, przechowujemy 100 μl porcji di-4-ANEPPS w temperaturze -20°C. Inne barwniki są również przechowywane w temperaturze -20°C. Rozpuszczoną blebbistatynę należy przechowywać w lodówce w temperaturze +4°C.
3. Przed pobraniem serca należy przenieść roztwór Tyrodesa do butelki o pojemności 2 litrów i umieścić go w łaźni wodnej (Fisher Scientific), która utrzymuje temperaturę roztworu na poziomie 37 °C. Roztwór natlenia się 95%_O2 - 5% CO_{2 .} pH utrzymuje się na poziomie 7,35±0,05 poprzez regulację poziomu natlenienia. Roztwór krąży w systemie perfuzyjnym Langendorffa i jest filtrowany przez nylonowy filtr siatkowy (wielkość porów: 11 μm, milipory) umieszczony w linii perfuzyjnej przed kaniulą.
4. Przygotuj sprzęt monitorujący przed zbiorem serca. Przetwornik ciśnienia (WPI) służy do monitorowania ciśnienia w aorcie podczas eksperymentu. Linia bazowa przetwornika ciśnienia jest ustawiona na zero mmHg, gdy serce nie jest podłączone do systemu perfuzyjnego. Elektrody pseudo-EKG umieszcza się w komorze w celu przybliżenia odprowadzenia I, II i III trójkąta EKG Einthovena.

2. Zbieranie i perfuzja serc królików

1. Zamocuj królika w ograniczniku dla królika. Poddaj królika eutanazji przez dożylne wstrzyknięcie pentobarbitalu sodu (50 mg/kg) z heparyną 2000 j. Kiedy królik zostaje całkowicie uśpiony, co jest determinowane brakiem odruchu bólowego, klatka piersiowa jest szybko otwierana, a serce i płuca są wycinane.
2. Wykonaj nacięcie na górnym końcu aorty wstępującej przed wszystkimi gałęziami łuku aorty. Wypłucz powietrze z aorty wstępującej, a następnie szybko kaniuluj serce do kaniuli o rozmiarze 16, która została wcześniej przymocowana do pułapki pęcherzykowej, która jest bardzo ważna dla utrzymania powietrza z dala od naczyń wieńcowych. Gdy serce zostanie wstecznie perfundowane w nierecyrkulacyjnym systemie perfuzyjnym Langendorffa, wykonaj nacięcie, aby szybko otworzyć osierdzie.
3. Usuń płuca, tchawicę, tłuszcz i tkankę łączną, podczas gdy krew jest wypłukiwana przez perfuzję.
4. Bardzo ważne! Silikonowa rurka (o długości ̃3 cm i średnicy 2 mm) jest wprowadzana przez żyłę płucną i zastawkę mitralną do lewej komory (LV) i utrzymywana tam przez cały czas trwania eksperymentu. Ta rurka uwalnia roztwór, który jest uwięziony w LV. Brak krążenia przez wiele godzin podczas eksperymentu perfuzji Langedorffa w mechanicznie unieruchomionym sercu, prawdopodobnie spowoduje ciężkie niedokrwienie w jamie lewej komory i wywoła arytmię.
5. Przenieś serce z kaniulą do recyrkulacyjnego systemu perfuzji Langendorffa za pomocą optycznego aparatu mapującego.

3. Przeprowadzanie eksperymentów za pomocą Panoramicznego Systemu Mapowania Optycznego

1. Umieść serce w specjalnie wykonanej sześciokątnej komorze i podłącz kaniulę do systemu perfuzyjnego. Utrzymuj ciśnienie w aorty na poziomie 60 ± 5 mmHg, regulując natężenie przepływu pompy perfuzyjnej. Monitor odprowadzenia I pseudo-EKG. Utrzymuj pH na poziomie około 7,35 ± 0,05.
2. Wyłącz światło w pomieszczeniu, ponieważ blebbistatyna jest fotoinaktywowana przez promieniowanie UV i niskie pasmo (450-490 nm)¹⁷ widzialnej części widma. Powoli wstrzykiwać roztwór podstawowy blibstatyny przez otwór iniekcyjne w pułapce pęcherzyków powietrza znajdującej się nad kaniulą. Powoli wstrzykiwać 0,1 ml blibistatyny na każde wstrzyknięcie w bolusie. Przed kolejnym wstrzyknięciem należy poczekać, aż ciśnienie się ustabilizuje.
3. Delikatnie umieść elektrodę stymulującą w miejscu specyficznym dla projektu eksperymentu.
4. Skoncentruj obraz serca w matowym szkle znajdującym się na płaszczyźnie obrazu każdej matrycy fotodiodowej (PDA) z trzech równomiernie rozmieszczonych kątów otaczających serce. Dostosuj położenie kaniuli i odległości między każdym PDA a sercem, aby dopasować serce do pola widzenia wszystkich trzech PDA. Zrób zdjęcie każdego wyostrzonego obrazu w matowym szkle.
5. Powoli wstrzyknąć 10 ̃20 μl roztworu podstawowego di-4-ANEPPS przez otwór iniekcyjne w pułapce pęcherzyków powietrza do roztworu perfuzyjnego. Odczekaj 1 ̃3 minuty przed wykonaniem nagrań optycznych.
6. Przy pierwszym nagraniu włącz zieloną diodę LED (bez filtra wzbudzenia, LED FLOOD, LUMILEDS), wykonuj nagrania optyczne jednocześnie z trzech palmtopów połączonych z niestandardowym systemem akwizycji danych5 i wyłącz światło LED. Sprawdź jakość sygnałów z różnych pikseli wszystkich trzech palmtopów. Dodać 0,1 ̃0,2 ml roztworu podstawowego blibstatyny, jeśli zauważy się artefakty ruchu w optycznym potencjale czynnościowym. Dodać kolejne 5 μl roztworu podstawowego di-4-ANEPPS, jeśli stosunek sygnału do szumu jest niski.
7. Ukończ opracowany protokół eksperymentalny dla badania funkcjonalnego. Ponownie zabarwić serce dodatkowym 5 μl roztworu podstawowego di-4-ANEPPS, jeśli sygnał pogorszy się podczas eksperymentów z powodu fotowybielania lub wymłukiwania.
8. Włącz światło w pomieszczeniu po zakończeniu badania funkcjonalnego. Rób zdjęcia serca pod 36 równomiernie rozmieszczonymi kątami. Osiąga się to poprzez obracanie serca w kroku 10° za pomocą kamery cyfrowej zamocowanej w miejscu jednego PDA.
9. Wyjmij serce z komory. Opróżnij wszystkie roztwory. Umyj system perfuzyjny w sekwencji wody DI, 70% alkoholu odczynnika i ponownie wody DI.
10. Analiza danych obejmuje rekonstrukcję geometrii serca na podstawie 36 zdjęć cyfrowych, rejestrację sygnału optycznego na powierzchni zrekonstruowanej geometrii oraz kwantyfikację czasu trwania potencjału czynnościowego (APD), prędkości przewodzenia (CV), fazy ^itp.6

4. Przeprowadzanie eksperymentów przy użyciu systemu podwójnego mapowania

1. (Kontynuuj po części 2) Umieść kaniulowane serce w szklanej komorze (Radnoti) i podłącz kaniulę do systemu perfuzyjnego. Przypnij serce do silikonowego dna komory na wierzchołku komory i przedsionkach.
2. Wyłącz światło w pomieszczeniu. Powoli wstrzyknąć roztwór podstawowy bróbstatyny (15 ̃20 min, aby osiągnąć 10 μM) przez port iniekcji przed kaniulą perfuzyjną w celu unieruchomienia serca.
3. Umieść plastikową szalkę Petriego lub inną szklaną osłonę okienną nad powierzchnią nasierdzia, aby zmniejszyć ruch powierzchni roztworu.
4. Ustaw ostrość dwóch kamer CMOS w systemie podwójnego mapowania (Ultima-L, SciMedia) w tym samym polu widzenia. Emitowana fluorescencja jest oddzielana przez zwierciadło dichroiczne (odcięcie 635 nm, Omega Optical) i filtrowana przez filtr długoprzepustowy 700 nm (Thorlabs) dla sygnałów napięciowych oraz przez filtr pasmowoprzepustowy 590/30 nm (Omega Optical) dla sygnałów wapniowych.
5. Skieruj światłowody dwóch lamp halogenowych (Newport Oriel Instruments, Stratford, CT; SciMedia, Costa Mesa, Kalifornia) w kierunku pola widzenia mapy, aby uzyskać równomierne oświetlenie. Stosowane są filtry wzbudzenia (531/40 nm, SemRock).
6. Wybarwić serce barwnikiem wrażliwym na napięcie, roztworem podstawowym RH 237 (10 ̃30 μL) przez otwór iniekcyjny.
7. Zmieszać roztwór podstawowy Rhod-2AM (0,2 ml) z Pluronic F-127 (Invitrogen, mieszanina 1:1). Sonikuj przez 1 minutę w sonikatorze w łaźni wodnej. Wstrzyknąć mieszaninę przez otwór łapacza pęcherzyków. Odczekaj około 20 minut, aby umożliwić deestryfikację Rhod-2 AM przed rozpoczęciem mapowania.
8. W przypadku jednego nagrania należy wyłączyć pompę superfuzyjną, aby uniknąć ruchu na powierzchni roztworu, włączyć źródło światła wzbudzającego (lampy halogenowe), wykonać nagrania optyczne za pomocą obu kamer podłączonych do systemu akwizycji danych (Ultima-L, SciMedia), wyłączyć lampkę wzbudzenia i włączyć pompę superfuzyjną. Sprawdź jakość sygnałów optycznych. W razie potrzeby ponownie zabarwić tkankę.
9. Dokończ pozostałą część zaprojektowanego protokołu eksperymentalnego dla badania.
10. Włącz światło w pomieszczeniu i zrób zdjęcie serca zawierającego pole widzenia. Wyjmij serce z komory. Opróżnij wszystkie roztwory. Umyj system perfuzyjny w sekwencji wody DI, 70% odczynnika alkoholowego (Fisher Scientific) i wody DI.
11. Analiza danych obejmuje pomiary APD, CV, czasu trwania przejściowego wapnia (CaTD), opóźnienia między wzrostem AP a wzrostem CaT, czasu narastania stanu przejściowego wapnia oraz stałej czasowej monowykładniczego dopasowania rozpadu CaT.

Reprezentatywne wyniki:

Rysunek 1. Reprezentatywne wyniki eksperymentu z królikami z perfuzją Langendorffa z wykorzystaniem panoramicznego systemu mapowania optycznego. (A) Widok z przodu serca królika i zrekonstruowana geometria serca królika w postaci trójwymiarowej powierzchni siatki-siatki. (B) Nieopakowana powierzchnia nasierdzia oznaczona kolorem przez fazę (uzyskaną z analizy płaszczyzny fazowej¹⁸) wskazującą czoło fali pokazane na czerwono podczas epizodu tachyarytmii. (C) Zapisy optycznego potencjału czynnościowego z pięciu miejsc wokół punktu osobliwości fazowej oznaczone cyframi 1-5 w panelu B. (D) Osiem migawek propagacji czoła fali aktywacyjnej (kolor czerwony) podczas cyklu stabilnej arytmii reentrantowej. Czoło fali krąży zgodnie z ruchem wskazówek zegara wokół osobliwości fazowej, która jest widoczna na przedniej powierzchni serca. Kolor repolaryzacji (niebieski) jest ustawiony na częściowo przezroczysty, tak aby tylne czoło fali było widoczne (np. przy 80 ms, 100 ms i 120 ms). Film przedstawiający tę nawrotną arytmię znajduje się w filmie uzupełniającym 1. Metody rekonstrukcji geometrii, rejestracji sygnałów, obliczania mapy fazowej i rozpakowywania powierzchni są szczegółowo opisane w innym miejscu⁶.

Rysunek 2. Reprezentatywne wyniki eksperymentu z perfuzją Langendorffa na sercu królika z wykorzystaniem systemu podwójnego mapowania (jednoczesne mapowanie potencjału czynnościowego i stanu przejściowego wapnia). (A) Przednia powierzchnia serca z polem widzenia odwzorowania pokrytym czarnymi kropkami. (B) Zbliżenie nagrań z jednego miejsca. (C) Próbki śladów potencjału czynnościowego (niebieski) i stanu przejściowego wapnia (czerwony) z układu równomiernie rozmieszczonych miejsc oznaczonych czarnymi kropkami w panelu A. Należy zauważyć, że nie wszystkie zapisy pikseli są pokazane, a rozdzielczość przestrzenna wynosi 200 μm.

Dyskusja

Opierając się na naszym doświadczeniu, kluczem do udanego eksperymentu z sercem królika z perfuzją Langendorffa jest dobrze przygotowany roztwór Tyrodesa, szybkie zbiory serca, dobrze utrzymane ciśnienie perfuzyjne i odpowiednie pH natlenionego roztworu w systemie perfuzyjnym. Aby zarejestrować sygnał o najwyższym możliwym stosunku sygnału do szumu, musimy wziąć pod uwagę takie czynniki, jak źródło światła, filtry optyczne, optyka skupiająca, fotodetektory^itp. Szczegółowe informacje na temat tych aspektów omówiono w innym miejscu¹⁹. Młode króliki (wiek: 4-5 miesięcy; waga: 7-9 funtów) mogą być używane do unikania tłuszczu nasierdziowego, który zmniejsza stosunek sygnału do szumu sygnałów optycznych.

Sygnał rejestrowany przez każdy piksel jest ważoną integracją światła emitowanego z objętości tkanki. Głębokość tej objętości tkanki zależy od długości fal wzbudzenia i emisji użytego barwnika. Na przykład w przypadku di-4-ANEPPS szacowana głębokość penetracji wynosi 300 μm w sercu królika²⁰. Dlatego interpretacja sygnału optycznego powinna być dokonywana z ostrożnością, gdy miejscowa niejednorodność funkcji elektrycznych występuje w węźle zatokowo-przedsionkowym, węźle przedsionkowo-komorowym oraz podczas arytmii komorowej ^1,21,22.

Jednym z ograniczeń techniki mapowania optycznego w porównaniu z zapisem elektrodowym jest to, że faza repolaryzacji optycznego potencjału czynnościowego jest często demineralizowana przez artefakt ruchu spowodowany skurczem serca. Ograniczenie mechaniczne może być użyte do zmniejszenia artefaktu, ale nie może go całkowicie wyeliminować. Dla porównania, farmakologiczne rozprzęgacze wzbudzenia-skurczu są skuteczne w usuwaniu artefaktu ruchu. Jednak te rozprzęgacze (np. monoksymus 2,3-butanodionu) mogą mieć znaczące elektrofizjologiczne skutki uboczne. Wykazano, że blebbistatyna nie ma żadnych niepożądanych skutków ubocznych dla elektrofizjologii serca w prawidłowym sercu²³, a zatem jest obiecującym środkiem rozprzęgającym do mapowania optycznego. Należy zauważyć, że przyspieszenie obrzęku spowodowane zniesieniem skurczu może również wpływać na elektrofizjologię.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
NaCl	Fisher Scientific	S271-1
CaCl2 (2H2O)	Fisher Scientific	C79-500
KCl	Fisher Scientific	S217-500
MgCl2 (6H2O)	Fisher Scientific	M33-500
NaH2PO4 (H2O)	Fisher Scientific	S369-500
NaHCO3	Fisher Scientific	S233-3
D-Glucose	Fisher Scientific	D16-1
Blebbistatin	Tocris Bioscience	1760
Di-4-ANEPPS	Invitrogen	D1199
RH237	Invitrogen	S1109
Rhod-2AM	Invitrogen	R1244
Pluronic F127	Invitrogen	P3000MP
Dimethyl sulphoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650