Pomiar właściwości lepkosprężystych tkanki mózgowej myszy za pomocą reometrii

Streszczenie

Źródło: Canovic, E. P., et al. Charakterystyka wieloskalowych właściwości mechanicznych tkanki mózgowej za pomocą mikroskopii sił atomowych, wgłębień udarowych i reometrii. J. Vis. Exp. (2016)

W tym filmie reometr został użyty do zastosowania kontrolowanego oscylacyjnego ruchu obrotowego do tkanki mózgowej w celu wygenerowania odkształcenia ścinającego i oceny właściwości lepkości i elastyczności tkanki. Reometr, jako narzędzie funkcjonalne, zapewnia wgląd w mechanikę mózgu podczas urazów lub chorób neurodegeneracyjnych.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Reologia
   1. Ustaw i skalibruj reometr zgodnie z instrukcjami producenta.
      1. Zainicjuj reometr, otwierając urządzenie/panel sterowania. Na karcie panelu sterowania kliknij "zainicjuj".
      2. Zamontuj płytkę pomiarową o średnicy 25 mm (PP25) i układ termiczny.
      3. (Opcjonalnie) Aby zmniejszyć poślizg między płytkami reometru a tkanką, wytnij samoprzylepne plastry papieru ściernego, które pasują do kształtu górnej płytki reometru i przyklej papier ścierny do górnej i dolnej płyty.
      4. Zetknij się między górną i dolną płytą, klikając "ustaw zerową szczelinę" na panelu sterowania.
      5. Wyzeruj przetwornik siły normalnej, klikając "resetuj siłę normalną".
      6. Przeprowadź test bezwładności, otwierając zakładkę serwis na panelu sterowania, klikając "system pomiarowy", a następnie klikając "test bezwładności". Zapisz starą i nową bezwładność. Sprawdź, czy bezwładność mieści się w dopuszczalnym limicie dla sondy, podanym przez producenta.
2. Załaduj próbkę do reometru.
   1. Po pobraniu tkanki i pokrojeniu segmentu koronalnego mózgu świni na grubość ~5 mm, przechowuj go na lodzie w podłożu niezależnym od CO2.
   2. Umieść mózg między dwiema płytkami. Usuń duże kropelki wody z górnej i dolnej powierzchni próbki, aby zapobiec poślizgowi, ale nie wysuszaj próbki.
   3. Powoli opuszczaj płytkę pomiarową, aż płytka znajdzie się w pełnym kontakcie z górną powierzchnią tkanki, a zmierzona normalna siła będzie stała na poziomie 0,01 mN po 5-10 minutowym okresie relaksacji.
      1. W panelu sterowania należy w polu pozycji pomiaru wprowadzać kolejno niższe wysokości i kliknąć "pozycja pomiaru", aby powoli opuścić płytkę pomiarową.
      2. W odległości milimetra od kontaktu z tkanką należy obniżyć płytkę pomiarową w odstępach co 0,1 mm, aż płytka całkowicie zetknie się z górną powierzchnią tkanki. Upewnij się, że zmierzona siła normalna wynosi stale 0,01 mN po 5-10 minutowym okresie relaksacji.
      3. Zapisz początkową zmierzoną siłę normalną. Powtarzane pomiary powinny być wykonywane przy tych samych naprężeniach ściskających/odkształceniach.
   4. Jeśli próbka przekracza średnicę płytki, przytnij ją plastikowym ostrzem. Odpipetować niewielką objętość (~1-2 ml) pożywki na krawędziach próbki, aby uwodnić tkankę.
   5. (Opcjonalnie) Opuść pokrywę termiczną. Na panelu sterowania ustaw temperaturę na 37 °C i kliknij "ustaw".
3. Wykonaj przemiatanie amplitudy, aby ustalić liniowy zakres lepkosprężystości materiału (i.e., odkształcenia ścinające, przy których G' i G'' przy interesujących nas częstotliwościach (e.g., 1 rad/s).
   1. Wybierz "plik/nowy". Pod zakładką żelu wybierz "Przemiatanie amplitudy: zakres LVE". Wybierz okno i kliknij "Pomiar 1: Przemiatanie amplitudy". Kliknij dwukrotnie pole oscylacji. Wprowadź szczep początkowy i końcowy (e.g., 0,01 do 105), częstotliwość (e.g., 1 rad/s) oraz liczbę punktów na dekadę (e.g., 6 punktów/dec). Wybierz "ok" i kliknij "Start".
   2. Powtórz tę procedurę dla kilku warstw z powtarzającymi się próbami, aby zapewnić spójność liniowego zakresu sprężystości. Ściskanie osiowe próbki powinno pozostać stałe między próbkami.
4. Przeprowadź przemiatanie częstotliwości tkanki przy odkształceniu w liniowym zakresie lepkosprężystym tkanki (np. odkształcenie 1%) i w interesującym nas zakresie częstotliwości (e.g., 0,1-100 rad/s).
   1. Kliknij "plik/nowy" i w zakładce żelu wybierz "Przemiatanie częstotliwości". Kliknij Okno/Pomiar 1: Przemiatanie częstotliwości. Kliknij dwukrotnie pole oscylacji. Wprowadź zakres częstotliwości (e.g., 0,1 do 100 rad/s), szczep (e.g., 1% szczepu) i liczbę punktów na dekadę (e.g., 6 punktów/dec). Wybierz "ok" i kliknij "Start", aby rozpocząć przemiatanie częstotliwości.
5. Powtórz przemiatanie częstotliwości (krok 1.4) w dwóch lub trzech powtórzeniach.

Przejrzyj dane, które są automatycznie obliczane i eksportowane przez reometr: G' i G" w funkcji częstotliwości (przemiatanie częstotliwości) lub odkształcenia ścinającego (przemiatanie amplitudy). UWAGA: G' i G'' próbki są obliczane na podstawie (maksymalnej) amplitudy reakcyjnego momentu obrotowego próbki T'0 i kąta odchylenia obrotowego (lub kąta odchylenia) φ° i opóźnienia fazowego φ, odpowiedzi próbki na przyłożone odkształcenie oscylacyjne (Rysunek 1):

gdzie R i h to promień i wysokość próbki.

Wyniki

Rysunek 1. Ilustracja eksperymentów z reometrem płytkowym równoległym. (A) Schemat eksperymentu z reometrem z płytką równoległą i definicje związane z zastosowanym oscylacyjnym odkształceniem ścinającym. (B) Reprezentatywne zastosowane odkszt...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Xylaxine	Lloyd Laboratoried		lek na receptę
Ketamina	AnaSed Zastrzyki na receptę		lek
Hibernate-A Medium	Gibco	A1247501	niezależny od CO2 neuronowy podłoże dla tkanek dorosłych
Reometr płytkowy równoległy MCR501	Anton-Parr	-
PP25	Płaska płytka pomiarowa o średnicy 25 mm	Anton-Parr-25
Samoprzylepny papier ścierny	McMaster-Carr	4184A48	można stosować alternatywnych dostawców
Loctite 4013 Klej błyskawiczny	Henkel	20268	alternatywni dostawcy mogą być

mm