Spektrometria mas plazmy sprzężonej z ablacją laserową do wizualizacji metali w tkance mózgowej myszy

Streszczenie

Źródło: Hare, D. J., et.al. Obrazowanie metali w tkance mózgowej metodą ablacji laserowej - plazma sprzężona indukcyjnie - spektrometria mas (LA-ICP-MS). J. Vis. Exp. (2017)

Ten film demonstruje zastosowanie spektrometrii mas plazmy sprzężonej indukcyjnie z ablacją laserową (LA-ICP-MS) do wizualizacji i ilościowego określenia rozkładu metali w tkance mózgowej myszy. Protokół obejmuje ablację laserową w celu wytworzenia aerozolu cząstek próbki, jonizację cząstek w plazmie wysokotemperaturowej oraz spektrometrię mas w celu oddzielenia jonów według ich stosunku masy do ładunku. Specjalistyczne oprogramowanie jest następnie wykorzystywane do generowania obrazów ilościowych, ujawniających przestrzenne rozmieszczenie metali w tkance.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Przygotowanie LA-ICP-MS do analizy

1. Umieść wzorce i próbkę w komorze ablacyjnej, upewniając się, że mieszczą się w głębi ostrości kamery CCD zamontowanej w jednostce LA. Jeśli konieczne jest strojenie instrumentu, dołącz odpowiedni materiał referencyjny (e.g. NIST 612 Pierwiastki śladowe w szkle). Dokręć palcami dwie śruby na drzwiach komory, aby uszczelnić komorę ablacyjną.
2. W oprogramowaniu ICP-MS wybierz otwórz zawór argonu w panelu "Konserwacja" lub podobnym i ustaw przepływ gazu nośnego na 1,2 l min^-1 w odpowiednim oknie dialogowym.
   UWAGA: W tym protokole argon jest używany jako gaz nośny. W kilku przykładach jako gaz nośny wykorzystuje się hel lub mieszaninę helu i argonu.
3. W oprogramowaniu LA kliknij przycisk "wyczyść", aby przepłukać ogniwo argonem przez co najmniej 30 minut.
   UWAGA: Czas czyszczenia można zmienić, klikając przycisk "czas czyszczenia" lub podobny. W przypadku korzystania z systemu ablacyjnego z dwuobjętościową komorą ablacyjną, należy okresowo przesuwać stolik do każdego rogu i przechodzić po przekątnej komórki, aby upewnić się, że jak najwięcej powietrza resztkowego zostało usunięte z komórki. Można to osiągnąć, wybierając "home stages" lub równoważną funkcję.
4. Włącz ICP-MS, klikając "plazma włączona" i pozwól mu się rozgrzać przez dwie godziny, podczas których można wykonać kroki 1,5 - 2,4. Ustawienia przyrządów różnią się w zależności od producenta.
5. Reprezentatywna ablacja wzorców tkankowych
   1. Wybierz narzędzie do linii i narysuj pojedynczą linię ablacji o długości około 3 mm na powierzchni tkanki.
   2. Ustaw parametry w następujący sposób, klikając prawym przyciskiem myszy linię ablacji na liście eksperymentów i zmieniając następujące: średnicę wiązki (wybraną odpowiednio przez użytkownika; używana jest tutaj wiązka kwadratowa 30 μm), prędkość skanowania (4-krotność średnicy wiązki na sekundę; 120 μm s^-1) i fluencję energii (0,3 -0,5 J cm^-2 dla tkanek miękkich; zoptymalizuj w razie potrzeby dla twardszych matryc). Przy grubości tkanki 30 μm wiązka lasera nie przenika przez całą grubość tej tkanki, eliminując wszelkie potencjalne zanieczyszczenia ze podłoża mikroskopu. Normalizacja do węgla może być wykorzystana do skorygowania zmian w ilości tkanki poddanej ablacji. Ustaw te parametry jako domyślne dla każdego kolejnego wiersza, wybierając przycisk radiowy "domyślne".
   3. Zduplikuj ten wiersz sześć razy, wybierając początkową linię, klikając prawym przyciskiem myszy i wybierając "zduplikowane skany". Upewnij się, że linie są przesunięte w osi x- lub y- o średnicę belki. Daje to w sumie siedem linii na standard, rozmieszczonych w odstępach zgodnie ze średnicą belki.
   4. Powtórz kroki 1.5.1 - 1.5.3 dla każdego wzorca, upewniając się, że linia ma identyczną długość.
6. Aby narysować obszar ablacji nad próbką, postępuj zgodnie z jedną z dwóch następujących metod:
   UWAGA: Upewnij się, że te same parametry skanowania (średnica wiązki, prędkość skanowania, fluencja energii) są używane dla linii próbkowania.
   1. Jeżeli system LA jest wyposażony w szerokie pole widzenia, należy wybrać narzędzie do tworzenia linii i narysować linię od lewego górnego rogu próbki na tyle długą, aby pokryć próbkę w jej najszerszym punkcie, przy użyciu tych samych parametrów lasera, które przedstawiono w ppkt 1.5. Zduplikować ten skan w sposób opisany w ppkt 1.5.3 z liniami rozmieszczonymi zgodnie ze średnicą wiązki tyle razy, ile jest to konieczne, aby zapewnić pełne pokrycie próbki.
   2. Jeśli widok szerokiego pola nie jest dostępny, określ i zapisz współrzędne x i y (zwykle wyświetlane na ekranie głównym jako "pozycja stołu" lub podobne) odpowiadające rogom prostokąta pokrywającego całą próbkę. Użyj tych współrzędnych, aby ustawić równoległe linie ablacji obejmujące cały obszar próbki.
   3. Narysuj linie do przerywanego skanowania wzorców najpóźniej po ~20 h skanowania próbki, powtarzając proces opisany w ppkt 1.5. W zależności od czasu skanowania próbki może to być wymagane wielokrotnie. Zakończ eksperyment dodatkowym skanem wzorców.
      UWAGA: Podczas określania współrzędnych x i y podczas czyszczenia komórki, wybranie pozycji początkowych i związana z tym kalibracja osi zmieni wcześniej uzyskane szczegółowe informacje dla współrzędnych x i y, podczas gdy różnica (, tj. długość linii) pozostanie niezmieniona.

2. Ustawianie metod akwizycji danych dla ICP-MS

1. W przypadku standardowej linii ablacji podziel długość linii przez prędkość skanowania laserowego, aby określić całkowity czas analizy dla pojedynczej linii. Powtórz tę czynność dla linii próbkowania.
2. W oprogramowaniu ICP-MS utwórz nową metodę (pokazaną tutaj jako "wsad") i upewnij się, że wybrano opcję "analiza czasowo-rozdzielcza" lub jej odpowiednik. Wybierz wartości m/z, które mają zostać wykryte, a następnie dostosuj czas całkowania dla każdego m/z tak, aby całkowity czas całkowania dla jednego cyklu wynosił 0,25 s. Kliknij "Zapisz partię jako" i nazwij odpowiednio (e.g., Std1).
   UWAGA: Ponieważ próbka będzie przechodzić przez wiązkę laserową z prędkością czterokrotnie większą od średnicy wiązki, zapewnia to rejestrację punktu danych dla każdej masy równej średnicy wiązki. Na przykład, przy użyciu rozmiaru plamki 100 μm, prędkość skanowania 400 μm s^-1 przy czasie integracji 0,25 s da obrazy o rzeczywistych rozmiarach pikseli. Czas integracji można dostosować w celu poprawy czułości; Przy zwiększaniu czasu integracji do 0,33 s prędkość skanowania powinna zostać zmniejszona do trzykrotności średnicy wiązki.
3. W przypadku norm wprowadź czas analizy dla każdej linii skanowania w odpowiednim polu oraz dodatkowe 15 sekund, aby uwzględnić czas nagrzewania i wymywania lasera. Wprowadź przykładową listę przebiegów (i. kolejność, w jakiej uruchamiane są skanowania) z taką samą liczbą przejęć (zwykle ponumerowanych sekwencyjnie; i.e. 001, 002, etc.) jako całkowita liczba linii standardowych.
4. W przypadku próbki należy zduplikować metodę stosowaną dla wzorców, zapisując bieżącą metodę lub partię z alternatywną nazwą pliku, a następnie dostosować całkowity czas akwizycji (w tym dodatkowe 15 s) i łączną liczbę akwizycji, aby dopasować liczbę linii, które będą ablować próbkę.
   UWAGA: Ponieważ większość systemów LA-ICP-MS używa jednokierunkowego wyzwalacza (LA wyzwala ICP-MS), ważne jest, aby oprogramowanie ICP-MS oczekiwało na wyzwalacz z LA przed rozpoczęciem kolejnej linii ablacji. W oknie akwizycji ICP-MS pojawi się komunikat "oczekiwanie na start".

3. Uruchamianie eksperymentu

1. Rozpocznij kolejkę ICP-MS, dodając pierwszą metodę lub partię do kolejki i upewnij się, że oprogramowanie oczekuje na wyzwalacz z systemu LA.
2. W oprogramowaniu LA włącz zasilanie lasera klikając "emisja", kliknij "uruchom" i ustaw czas nagrzewania lasera na 10 s i czas wymywania na 20 s w odpowiednich polach.
   UWAGA: To przekroczenie zapewni, że ICP-MS będzie gotowy do rozpoczęcia zbierania nowych danych, gdy laser rozpocznie każdą kolejną linię ablacji.
3. Rozpocznij sekwencję laserową, klikając "start". Jeśli używasz kuwety o dwóch objętościach, upewnij się, że kubek na próbkę jest na swoim miejscu.

4. Obliczanie standardów ilościowych

UWAGA: Istnieje wiele wariantów konwersji danych ICP-MS na obrazy. Obejmują one korzystanie z domowych narzędzi programowych napisanych w językach open source, komercyjnych makr i oprogramowania do analizy danych. W tym przypadku skorzystaj z niedawno opracowanej wtyczki programowej, opartej na specjalistycznym pakiecie do analizy danych LA-ICP-MS.

1. Przenieś wszystkie foldery wsadowe zawierające dane uruchomienia (001.d, 002.d, etc.) na osobny komputer z zainstalowanym oprogramowaniem analitycznym. Wyodrębnij pliki danych *.csv dla każdego wiersza partii do osobnego folderu.
   UWAGA: Używanie skryptu do automatycznego przesyłania plików *.csv do nowego folderu jest wysoce zalecane. Aby uzyskać więcej informacji, zobacz załączony kod języka Python. Ten skrypt został napisany tak, aby pasował do Agilent 7700 lub 8800 Series ICP-MS, ale może być edytowany tak, aby pasował do pliku wyjściowego innych producentów.
2. Otwórz platformę oprogramowania i postępuj zgodnie z zakładkami sekwencyjnie, aby zaimportować i przeanalizować standardy w celu uzyskania obrazów ilościowych, jak opisano poniżej.
3. Aby zaimportować dane z pierwszej standardowej partii, wybierz "Agilent .csv" jako "Typ pliku", "Cały folder" jako "Typ importu" i sprawdź, czy "Format daty" jest identyczny z formatem komputerowym. Kliknij 'Importuj', wybierz folder zawierający pliki .csv dla pierwszego zestawu standardów i przejdź do zakładki 'Linie bazowe'.
4. Odejmowanie linii bazowej
   1. Użyj zakładki 'Automatyczne wybory' (polecenie 2) z głównego menu rozwijanego aplikacji na pasku narzędzi, wybierz 'Informacje z importu' i kliknij 'Kontynuuj'.
   2. Kliknij "Zaznacz wszystko" i wybierz "Baseline_1" do integracji.
   3. Aby wybrać pierwsze 10 s każdej linii skanowania (odpowiadające czasowi nagrzewania lasera), przytnij dane, wprowadzając wartości sekundowe "0" i "(czas trwania linii - 10 s)" i kliknij "Dodaj integracje" (np. dla linii skanowania 35 s wprowadź wartości "0" i "25").
5. Aby wybrać przykładowe dane, użyj zakładki "Automatyczne wybory" zgodnie z opisem w 4.4, ale wybierz "Output_1" jako integrację. Przytnij dane od początku i końca każdej standardowej linii, aby wykluczyć sygnał tła (e.g. dla linii skanowania trwającej 35 sekund, wprowadź wartości "13" i "4").
6. Aby wykluczyć spadki sygnału spowodowane ewentualnymi dziurami w standardach, w zakładce 'Samples' kliknij 'Channels' w lewym górnym rogu obszaru wykresu, aby wybrać kanał o wysokim stosunku sygnału do szumu (e.g., C13 lub P31). Zanotuj wszelkie gwałtowne spadki sygnału i wybierz wartość CPS na tyle niską, która jest poniżej normalnej zmienności w próbkach, ale wystarczająco wysoką, aby wychwycić ostre spadki sygnału.
7. Kliknij zakładkę "DRS" i wybierz "Baseline_Subtract" dla "Aktualnego schematu redukcji danych". Wybierz kanał z 4.6 dla "Index Channel" i wartość CPS dla "Threshold do użycia podczas maskowania słabych sygnałów". Wstaw wartość <0,5 s dla opcji "Sekundy do trymowania przed/po słabych sygnałach", aby uwzględnić opóźnienie w przesyłaniu sygnału z lasera do ICP-MS.
8. Aby potwierdzić odpowiednie maskowanie obszarów o niskim sygnale, kliknij z powrotem na zakładkę 'Samples' i wybierz przetworzony (e.g., Fe56_CPS) ślad kanału. W razie potrzeby powtórzyć i doprecyzować wartości CPS i "Sekundy do przycięcia przed/po niskich sygnałach", jak w 4.7.
9. Kliknij zakładkę "Wyniki" i wybierz "Eksportuj dane" z głównego menu rozwijanego aplikacji. Wprowadź nazwę pliku, aby wygenerować plik danych arkusza kalkulacyjnego z wynikami (e.g., Obliczenia Std1, Std2...).
10. Otwórz plik danych w odpowiednim programie do obsługi arkuszy kalkulacyjnych i oblicz wartości CPS dla każdego kanału, który ma zostać określony ilościowo. Użyj wstępnie określonych stężeń metali z nebulizacji roztworu ICP-MS, aby obliczyć współczynnik konwersji z wartości CPS na ppm (μg g⁻¹) dla każdego elementu kwantyfikowalnego.
11. Powtórz kroki od 4.3 do 4.10 dla wszystkich zestawów norm w przebiegu.

5. Konstruowanie obrazów ilościowych

1. Wpisz "Biolite()" w wierszu polecenia, aby otworzyć oprogramowanie.
2. Zaimportuj przykładowe dane, klikając "Załaduj obrazy" i wybierając folder zawierający pliki .csv dla przykładowego obrazu.
3. Korekcja tła
   1. Kliknij zakładkę 'Linie bazowe', aby zastosować korekcję tła dla próbki. Na obrazie fosforu (P31) wyświetlanym na ekranie zaznacz obszary tła za pomocą narzędzia do rysowania prostokąta. Wybranie tak wielu obszarów, jak to możliwe, tworzy mapę dryfu sygnału/plazmy obejmującą cały obraz, aby zapewnić odpowiednią kompensację tych czynników zakłócających.
   2. Aby sygnał tła był bardziej widoczny, wybierz narzędzie do edycji wykresu (lewy górny róg wyświetlanego obrazu) i kliknij obraz prawym przyciskiem myszy. Wybierz opcję "Modyfikuj wygląd obrazu" i zmień "Pierwszy kolor przy Z=" na dużą wartość ujemną (e. -100 000). Kontynuuj, klikając "Gotowe".
4. Kliknij zakładkę "Standardy", aby wyświetlić tabelę współczynników korekcyjnych CPS/ppm. Wprowadź wartości obliczone na podstawie norm w kroku 4.10 dla każdego z elementów. Ten krok pomoże skorygować odchylenie czułości w ICP-MS. Kliknij przycisk "Idź!".
5. Otwórz "Przeglądarkę danych" z zakładki "Dane", która zawiera obrazy dla każdego elementu i każdego kroku.
6. Aby sfinalizować obraz do eksportu, wybierz żądany obraz w folderze "StdCorrImages", kliknij prawym przyciskiem myszy nazwę obrazu (*_ppm) i kliknij "Nowy obraz". Kliknij obraz prawym przyciskiem myszy, aby otworzyć "Modyfikuj wygląd obrazu", aby wybrać żądaną tabelę kolorów i skalę kolorów. Dodaj skalę kolorów do obrazu, klikając obraz prawym przyciskiem myszy i wybierając opcję "Dodaj adnotację". Wybierz "ColorScale" z menu rozwijanego w lewym górnym rogu i użyj zakładek, aby zmodyfikować żądaną skalę kolorów.
7. Aby wyeksportować obraz, upewnij się, że dany obraz jest zaznaczony i przejdź do zakładki "Plik" i kliknij "Zapisz grafikę...". Wybierz żądany format i zapisz obraz. Alternatywnie wybrany obraz można przesłać za pomocą narzędzi do kopiowania i wklejania.
8. Powtórz kroki 5.6 i 5.7 dla wszystkich interesujących obrazów.
9. Kwantyfikacja regionów dyskretnych
   1. Aby aktywować narzędzia ROI, przejdź do zakładki 'Analiza', 'Pakiety' i wybierz 'Przetwarzanie obrazu'.
   2. Wybierz żądany obraz i przejdź do zakładki "Obraz" i kliknij "ROI...". Kliknij "Rozpocznij rysowanie ROI" i użyj narzędzia do rysowania, aby wybrać interesujący Cię obszar w próbce. Aby zakończyć rysowanie, kliknij "Zakończ ROI".
   3. Aby uzyskać statystyki dla wybranego ROI, przejdź do zakładki "Obraz" i kliknij "Statystyki...".
   4. Skopiuj wyniki i wklej je do osobnego arkusza kalkulacyjnego. Powtórz wybór ROI (5.9.2) dla wszystkich regionów i elementów zainteresowania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szkiełka mikroskopowe ze szkła sodowego	n/a	n/a	Typowe szkiełka są odpowiednie do wszystkich eksperymentów
NWR213 System ablacji laserowej	ESI Ltd	n/a	Używane w tych eksperymentach. Inni producenci odpowiedni, mogą wymagać modyfikacji protokołu
Agilent 8800 Series ICP-MS	Agilent Technologies	n/a	Używane w tych eksperymentach. Inni producenci odpowiedni, mogą wymagać modyfikacji protokołu
Iolite	Iolite Software	n/a	Dostępne w http://iolite-software.com/. Inne metody są dostępne, patrz protocol
Excel	Microsoft	n/a
IGOR Pro	Metryki fali	n/a	Dostępne od https://www.wavemetrics.com/products/igorpro/igorpro.htm