Obrazowanie drugiej generacji harmonicznych w modelu szczurzym w celu zbadania wad tubuliny

Streszczenie

Źródło: Piazza, V., et al., Bezznacznikowa optyka nieliniowa do badania defektów zależnych od tubuliny w centralnej mielinie. J. Vis. Exp. (2023)

Ten film przedstawia procedurę obrazowania nieprawidłowości mikrotubul w wycinku tkanki mózgowej szczura za pomocą mikroskopu wzbudzenia dwufotonowego. Wykorzystuje sygnały drugiej generacji harmonicznej (SHG) do wykrywania wad tubuliny i zmniejszonej produkcji mieliny.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Przenieś do mikroskopu

1. Jeśli mikroskop znajduje się w innym pomieszczeniu, przygotuj izolowane pudełko z ocieplonymi okładami żelowymi do przenoszenia skrawków tkanki przy zachowaniu temperatury. Pole utrzyma również sekcje w cieple, dopóki nie zostaną zobrazowane.
2. Umieść próbkę pod mikroskopem i upewnij się, że jest prawidłowo umieszczona pod obiektywem, prowadząc bezpośrednią obserwację przez okulary ze światłem przechodzącym.
   UWAGA: Celem jest dostosowanie przewidywanych struktur emitujących do kierunku oscylacji lasera, aby zmaksymalizować emitowany (a tym samym wykryty) sygnał generowania drugiej harmonicznej (SHG).
3. Usunąć nadmiar HBSS tak, aby cienka warstwa cieczy pokryła całą próbkę. Co kilka minut należy sprawdzać wzrokowo film cieczy, aby uniknąć nadmiernego parowania i wysuszenia próbki.
   UWAGA: W opisanych warunkach sekcja jest używana nie dłużej niż 20 minut. Wysuszenie próbki powoduje drastyczne efekty artefaktów (Rysunek 1A). Jeśli potrzebne są dłuższe czasy obrazowania, zaleca się okresowe moczenie przekroju w ciepłym, świeżym podłożu zamiast dodawania większej ilości HBSS. Stosowanie komór perfuzyjnych i kleju lub niskotopliwej agarozy do unieruchomienia tkanki jest również zalecane, gdy mają być wykonywane dłuższe eksperymenty.
4. Przygotuj stolik mikroskopowy do obrazowania bez deskanowania, które może obejmować zamknięcie wszystkich drzwi ciemnej komory inkubacyjnej lub przykrycie komory inkubacyjnej czarną nylonową tkaniną pokrytą poliuretanem.

2. Obrazowanie

1. Wybierz tryb obrazowania "nieopisany" wzdłuż ścieżki transmisji. W ten sposób wychwytywanie słabego sygnału SH tubuliny zostanie zoptymalizowane.
2. Wybierz obiektyw LCI Plan-Neofluar 25x/0,8 NA.
3. Ustaw moc lasera w zakresie od 13 mW do 26 mW, z czasem przebywania pikseli 12,6 μs. Rób zdjęcia nie większe niż 512 x 512 pikseli, z prędkością 5 i średnią 2, przez średni czas akwizycji około 15 s.
   UWAGA: Użycie większej mocy lasera i/lub dłuższego czasu przebywania może spowodować uszkodzenie próbki (Rysunek 1B).
4. Najpierw zrób zdjęcia za pomocą filtra krótkoprzepustowego 485 nm (SP485), a w drugim kroku dodaj ostry filtr pasmowoprzepustowy 405 nm (BP405; Rysunek 2).
   UWAGA: Obrazy pseudo-jasnego pola mogą być wykonane przez ten sam detektor przy użyciu szczątkowego światła laserowego linii widzialnej (najlepiej sprawdzają się lasery o długości fali 405 nm lub 488 nm).

Wyniki

Rysunek 1: Przykłady artefaktów. (A) Artefakt spowodowany wysuszeniem próbki. (B) Artefakt z powodu nadmiernej ekspozycji. Paski skali: 30 μm.

Materiały