Poklatkowe obrazowanie konfokalne dynamiki dendrytycznej neuronów w eksplantatach siatkówki myszy

Streszczenie

Źródło: Ing-Esteves, S. & Lefebvre, J. L. Obrazowanie poklatkowe arboryzacji neuronów przy użyciu rzadkiego znakowania wirusem związanym z adenowirusem genetycznie ukierunkowanych populacji komórek siatkówki. J. Vis. Exp. (2021)

Ten film demonstruje zastosowanie mikroskopii konfokalnej do wizualizacji dynamiki dendrytycznej w żywych eksplantatach siatkówki myszy. Przedstawiono w nim etapy stabilizacji siatkówki pod mikroskopem konfokalnym, wykonywania obrazowania epifluorescencyjnego w celu wizualizacji interneuronów amakrynowych gwiazdotwórczych oraz przechwytywania poklatkowych obrazów 3D w celu monitorowania zmian w morfologii dendrytycznej amakryny.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Poklatkowe obrazowanie konfokalne preparatów siatkówki na żywo z całego montażu

1. Zmontuj komorę inkubacyjną do obrazowania na żywo dla pionowego mikroskopu konfokalnego, jak pokazano na Rysunek 1.
   UWAGA: W przypadku odwróconych systemów konfokalnych, płaskie mocowania są umieszczane w komórkach zwojowych siatkówki (RGC) stroną do dołu bezpośrednio na szklanym dolnym szkiełku nakrywkowym komory inkubacyjnej. Gdy siatkówki zetkną się ze szkiełkiem nakrywkowym, nie można ich przesunąć.
2. Napełnij komorę natlenionym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (aCSF) i włącz pompę oraz regulator temperatury (temperatura 32-34 °C, natężenie przepływu 1 ml/min). Nie pozwól, aby temperatura wzrosła powyżej 34 °C.
3. Aby przenieść płaski montaż siatkówki do komory perfuzyjnej, zatrzymaj pompę i usuń aCSF, który znajduje się w komorze. Umieścić krążek z mieszanym estrem celulozy (MCE) z płaskim mocowaniem siatkówki w (pustej) komorze inkubacyjnej.
4. Umieścić próbkę odważnika na płaskim uchwycie; Wstępnie zwilż ciężar, aby złamać napięcie powierzchniowe. Napełnij komorę podgrzanym aCSF i cyrkuluj aCSF z prędkością ~1 ml/min.
5. Umieść końcówkę z 25-krotnym obiektywem do zanurzania w wodzie (apertura numeryczna 0,95) do komory obrazowania. Ekran dla oznaczonych komórek zainteresowania za pomocą światła epifluorescencyjnego (Rysunek 1C).
6. Dostosuj głośność obrazowania, aby uchwycić interesujące cechy dendrytyczne.
   UWAGA: To badanie uchwyciło kompletną altanę dendrytyczną w rozdzielczości 1024 x 1024 pikseli na klatkę, kroku z 1 μm i szybkości odświeżania 2 min między każdym stosem z. Ostateczne rozmiary obrazu to ~100 μm x 100 μm x 20 μm.
7. Aby dostosować moc lasera do optymalnego ustawienia, użyj tabeli przeglądowej, która identyfikuje zarówno przesycone, jak i nienasycone piksele. Podczas skanowania dostosuj moc lasera tak, aby żadne piksele nie były przesycone (tj. przy intensywności 255 lub większej). Kontynuuj obrazowanie tak długo, jak jest to wymagane lub do momentu, gdy nastąpi znaczny i wykrywalny spadek sygnału fluorescencyjnego i wzrost szumów (zwykle 2-4 godziny).
   UWAGA: Zalecana jest zmniejszona moc lasera, ponieważ algorytmy dekonwolucji działają optymalnie, gdy piksele są rozmieszczone w pełnym zakresie dynamiki. Intensywność pikseli nie powinna przekraczać 254; Empiryczne analizy neurytów wykazały, że wartości pikseli poniżej 170 są idealne do dekonwolucji. Duże prędkości skanowania (400-600 Hz) z uśrednianiem linii (2-3) są lepsze niż pojedyncze, wolniejsze skany o tym samym całkowitym czasie przebywania pikseli. Obszar długotrwałego obrazowania często ulega fotowybielaniu, ale inne skrawki eksplantacji pozostają żywotne. Można obrazować wiele obszarów w montażu płaskim, każdy przez 2-4 godziny, z całkowitym czasem inkubacji wynoszącym 6 godzin. Sesje obrazowania trwające dłużej niż 6 godzin nie były systematycznie badane. Degradacja neurytów i pęcherzenie są oznakami, że żywotność eksplantatu spada.

Wyniki

Rysunek 1: Konfiguracja komory inkubacyjnej do obrazowania żywych komórek. (A) Aparatura do inkubacji do obrazowania na żywo pokazująca składniki grzewcze, roztworowe i obrazowania. Podwójna grzałka zawiera podgrzewaną platformę komory inkuba...

Materiały