Poklatkowe obrazowanie konfokalne dynamiki dendrytycznej neuronów w eksplantatach siatkówki myszy

Streszczenie

Źródło: Ing-Esteves, S. & Lefebvre, J. L. Obrazowanie poklatkowe arboryzacji neuronów przy użyciu rzadkiego znakowania wirusem związanym z adenowirusem genetycznie ukierunkowanych populacji komórek siatkówki. J. Vis. Exp. (2021)

Ten film demonstruje zastosowanie mikroskopii konfokalnej do wizualizacji dynamiki dendrytycznej w żywych eksplantatach siatkówki myszy. Przedstawiono w nim etapy stabilizacji siatkówki pod mikroskopem konfokalnym, wykonywania obrazowania epifluorescencyjnego w celu wizualizacji interneuronów amakrynowych gwiazdotwórczych oraz przechwytywania poklatkowych obrazów 3D w celu monitorowania zmian w morfologii dendrytycznej amakryny.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Poklatkowe obrazowanie konfokalne preparatów siatkówki na żywo z całego montażu

1. Zmontuj komorę inkubacyjną do obrazowania na żywo dla pionowego mikroskopu konfokalnego, jak pokazano na Rysunek 1.
   UWAGA: W przypadku odwróconych systemów konfokalnych, płaskie mocowania są umieszczane w komórkach zwojowych siatkówki (RGC) stroną do dołu bezpośrednio na szklanym dolnym szkiełku nakrywkowym komory inkubacyjnej. Gdy siatkówki zetkną się ze szkiełkiem nakrywkowym, nie można ich przes....

Wyniki

Rysunek 1: Konfiguracja komory inkubacyjnej do obrazowania żywych komórek. (A) Aparatura do inkubacji do obrazowania na żywo pokazująca składniki grzewcze, roztworowe i obrazowania. Podwójna grzałka zawiera podgrzewaną platformę komory inkuba.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bibuły filtracyjne z mieszaną membraną estrową celulozy (MCE), hydrofilowe, 0,45 μm	Millipore	HABG01 300
Polietylenowa jednorazowa pipeta transferowa	VWR	470225-034
Komora rurka polietylenowa, PE-160 10'Warner	Instruments	64-0755
Dwukanałowy sterownik grzałki, model TC-344C	Warner Instruments	64-2401
HC FLUOTAR L 25x/0,95 W VISIR Kabel
	Warner Instruments	CC-28
Duża komora inkubacyjna do kąpieli z Wsparcie dla plastrów	Warner Instruments	RC-27L
MPII Mini pompa perystaltyczna	Aparatura Harvard	70-2027
PM-6D Magnetyczna podgrzewana platforma (grzałka komory inkubacyjnej)	Warner Instruments	PM-6D
do minipompy perystaltycznej MPII	Aparat Harvard	55-4148
Kotwica do próbki (harfy)	Warner Instruments	64-0260	Kotwica próbki musi być kompatybilna z komorą inkubacyjną
Sloflo In-line Solution Heater	Warner Instruments	SF-28
Dwuwodny chlorek wapnia	Sigma-Aldrich	C7902
Carbogen (5% CO₂, 95% O₂)	AirGas	X02OX95C2003102	Dostawca może się różnić w zależności od regionu
D-(+)- Glukoza	Sigma-Aldrich	G7021
- HEPES, Free Acid	Bio Basic	HB0264
Kwas solny roztwór 1 N	Sigma-Aldrich	H9892
Sześciowodny chlorek magnezu	Sigma-Aldrich	M2670
paski testowe pH (6,0-7,7)	VWR	BDH35317.604
Potas chlorek (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541
Chlorek sodu (NaCl)	Bio Basic	DB0483
Jednozasadowy fosforan sodu	Sigma-Aldrich	RDD007
ImageJ	National Institutes of Health (NIH)	Open source

sterownika grzałki Leica 15506374 Rurki głowicy pompy