Obrazowanie i kwantyfikacja regeneracji aksonów w akskotomizowanych neuronach zwojowych siatkówki szczura

Streszczenie

Źródło: Portela-Lomba, M., et. al. Kokultura aksotomizowanych neuronów zwojowych siatkówki szczura z glejem osłonki węchowej, jako model in vitro regeneracji aksonów u dorosłych. J. Vis. Exp. (2020).

Ten film przedstawia obrazowanie i kwantyfikację regeneracji aksonów w aksotomizowanych neuronach zwojowych siatkówki szczura (RGN) współhodowanych z unieśmiertelnionymi ludzkimi komórkami glejowymi otaczającymi węch. RGN są znakowane immunologicznie, z czerwonymi somi i zielonymi aksonami. Obrazy zostały uchwycone za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego, a odsetek neuronów ze wskaźnikiem regeneracji aksonów i aksonów określono ilościowo za pomocą oprogramowania do obrazowania.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Hodowla gleju ludzkiego węchu i osłonki węchowej (ihOEG, Ts12 i Ts14)

UWAGA: Ta procedura jest wykonywana w sterylnych warunkach w komorze bezpieczeństwa biologicznego do hodowli tkankowej.

1. Przygotować 50 ml pożywki ME10 OEG.
2. Przygotuj 5 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle Medium firmy Dulbecco lub DMEM/F12-płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
3. Ogrzewać obie pożywki w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej przez 15 minut.
4. Rozmrozić fiolki z komórkami Ts12 i Ts14 w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.
5. Ponownie zawiesić i dodać komórki do pożywki hodowlanej DMEM/F12-FBS przygotowanej w kroku 2.
6. Wirować przez 5 minut przy 200 x g.
7. Aspirować supernatant.
8. Dodać 500 μl pożywki ME10 i ponownie zawiesić osad.
9. Przygotuj naczynie do hodowli komórkowej p60 z 3 ml ME10 i dodaj zawiesinę komórkową kroplami.
10. Przesuń, aby równomiernie rozprowadzić komórki na płytce.
11. Hodowla komórek w temperaturze 37 °C w 5% CO₂.
    UWAGA: Po osiągnięciu konfluencji, należy wykonać co najmniej kolejne przejście, aby zoptymalizować komórki pod kątem kokultury. 90% konfluencji jest potrzebne przed wysiewem ich na szkiełkach nakrywkowych w celu kokultury. Zlewający się p-60 ma średnią liczbę komórek 7 x 10⁵ dla Ts14 i 2,5 x 10⁶ dla linii komórkowych Ts12. Linie komórkowe Ts12 i Ts14 należy przechodzić co 2–3 dni.

2. Przygotowanie ihOEG (Ts12 i Ts14) do testu

UWAGA: Ten krok należy wykonać 24 godziny przed rozwarstwieniem neuronów zwojowych siatkówki (RGN) i kokulturą.

1. Szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm należy traktować 10 μg/ml poli-L-lizyny (PLL) przez 1 godzinę.
   UWAGA: Szkiełka nakrywkowe można pozostawić na noc w roztworze PLL.
2. Umyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie 1x solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS).
3. Odłącz komórki Ts12 i Ts14 ihOEG od naczynia do hodowli komórek p60.
   1. Dodać 4 ml pożywki hodowlanej DMEM/F12-FBS do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Ogrzewać w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.
   2. Usunąć pożywkę z płytek i przemyć komórki raz 1 ml 1x PBS-kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA).
   3. Dodać 1 ml trypsyny-EDTA do komórek OEG i inkubować przez 3–5 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO₂.
   4. Zebrać komórki za pomocą pipety p1000 i przenieść je do pożywki przygotowanej w kroku 3.1.
   5. Wirować przez 5 minut przy 200 x g.
   6. Aspirować supernatant.
   7. Dodać 1 ml pożywki ME10 i ponownie zawiesić osad.
   8. Policz numer komórki w hemocytometrze.
4. Wysiać 80 000 komórek Ts14 lub 100 000 komórek Ts12 / basenik na szkiełkach nakrywkowych na 24-dołkowych płytkach w 500 μl pożywki ME10.
5. Hodowla komórek w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ przez 24 godziny.

3. Rozwarstwienie tkanki siatkówki

UWAGA: Jako źródło RGN stosuje się 2-miesięczne samce szczurów rasy Wistar. Dwie siatkówki (jedna szczura) na 20 dołków 24-dołkowej płytki komórkowej. Autoklaw materiału chirurgicznego przed użyciem. Zestaw do dysocjacji papainy jest kupowany komercyjnie (Tabela materiałów). Należy postępować zgodnie z instrukcjami dostawcy dotyczącymi rekonstytucji. Rozpuścić D, 2-amino-5-fosfonowalerianowy kwas (APV) w 5 mM podstawowym roztworze i przygotować podwielokrotności.

1. W dniu testu należy przygotować następujące podłoża.
   1. Przygotuj naczynie do hodowli komórek p60 z 5 ml zimnego roztworu soli Earle's Balanced Salt Solution lub EBSS (fiolka 1 zestawu do dysocjacji papainy).
   2. Przygotować naczynie do hodowli komórek p60 z odtworzoną fiolką 2 (papainą) zestawu do dysocjacji papainy oraz 50 μl APV. Następnie dodać 250 μl odtworzonej fiolki 3 (DNaza plus 5 μL APV).
   3. W sterylnej probówce wymieszać 2,7 ml fiolki 1 z 300 μl fiolki 4 (inhibitor proteazy albuminowo-jajnikowej). Dodać 150 μl fiolki 3 (DNazy) plus 30 μl APV.
   4. Przygotuj 20 ml pożywki Neurobasal-B27 (NB-B27).
2. Złóż ofiarę ze szczura przez uduszenie za pomocą CO₂.
3. Usuń głowę przez ścięcie gilotyny; umieść go na szalce Petriego o średnicy 100 mm i spryskaj głowicę 70% etanolem przed umieszczeniem jej w okapie z przepływem laminarnym.
4. Obetnij wąsy szczura nożyczkami, aby nie przeszkadzały w manipulacji oczami.
5. Chwyć nerw wzrokowy kleszczami, aby wyciągnąć gałkę oczną na tyle, aby móc wykonać nacięcie w poprzek oka skalpelem.
6. Usuń soczewkę i ciało szkliste i wyciągnij siatkówkę (tkankę podobną do pomarańczy), podczas gdy pozostałe warstwy oka pozostają w środku (w tym warstwa nabłonka pigmentowego).
7. Umieścić siatkówkę w naczyniu do hodowli komórkowej p60 przygotowanym w kroku 3.1.1.
8. Przenieś siatkówkę do naczynia do hodowli komórek p60 przygotowanego w kroku 3.1.2 i pokrój ją skalpelem na małe kawałki o przybliżonej wielkości < 1 mm.
9. Przenieś do plastikowej probówki o pojemności 15 ml.
10. Inkubować tkankę przez 30 minut w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO₂, mieszając co 10 minut.
11. Dysocjuj grudki komórek, pipetując w górę iw dół szklaną pipetą Pasteura.
12. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 200 x g przez 5 minut.
13. Odrzucić supernatant i w celu dezaktywacji papainy, ponownie zawiesić osad komórkowy w roztworze przygotowanym w kroku 3.1.3. (1,5 ml na 2 oczy).
14. Ostrożnie odpipetować zawiesinę komórkową do 5 ml przygotowanej fiolki 4.
15. Wirować przy 200 x g przez 5 minut.
16. Podczas wirowania całkowicie usuń pożywkę ME-10 z płytki komory OEG 24-dołkowej (wcześniej przygotowanej w kroku 2) i zastąp ją 500 μl pożywki NB-B27 na dołek.
17. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 2 ml pożywki NB-B27.
18. Płytka 100 μl zawiesiny komórek siatkówki, na dołek płytki m24, na monowarstwy nakrywki poddane działaniu PLL lub OEG.
19. Utrzymuj kultury w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 96 godzin w pożywce NB-B27.

4. Barwienie immunologiczne

1. Po 96 godzinach utrwal komórki przez 10 minut, dodając tę samą objętość 4% paraformaldehydu (PFA) w 1x PBS do pożywki hodowlanej (600 μL) (stężenie końcowe PFA 2%).
2. Usuń pożywkę i PFA z płytki 24-dołkowej i ponownie dodaj 500 μl 4% paraformaldehydu (PFA) w 1x PBS. Inkubować przez 10 minut.
3. Wyrzuć utrwalacz i przemyj 3 razy 1x PBS przez 5 minut.
4. Blokuj 0,1% Triton X-100/1% FBS w PBS (PBS-TS) przez 30–40 min.
5. Przygotuj przeciwciała pierwszorzędowe w buforze PBS-TS w następujący sposób: Przeciwciało monoklonalne SMI31 (przeciwko białkom MAP1B i NF-H) (1:500). 514 (rozpoznaje białka MAP2A i B) królicza surowica poliklonalna (1:400).
6. Dodać przeciwciała pierwszorzędowe do kokultur i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
7. Następnego dnia wyrzuć przeciwciała i przemyj szkiełka nakrywkowe 1x PBS, 3 razy, przez 5 minut.
8. Przygotuj przeciwciała drugorzędowe w buforze PBS-TS w następujący sposób: Dla SMI-31, anty-mysz Alexa Fluor 488 (1:500). Dla 514 anty-królik Alexa-594 (1:500).
9. Inkubować komórki z odpowiednimi fluorescencyjnymi przeciwciałami drugorzędowymi przez 1 godzinę, w temperaturze pokojowej lub w temperaturze pokojowej w ciemności.
10. Umyj szkiełka nakrywkowe 1x PBS, 3 razy, przez 5 minut, w ciemności.
11. Na koniec zamontuj szkiełka nakrywkowe z podłożem montażowym (Tabela materiałów) i utrzymuj je w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: W razie potrzeby można przeprowadzić barwienie jąder fluorescencyjnych DAPI (4,6-diamidino-2-fenyloindol). Przed montażem inkubować komórki przez 10 minut w ciemności z DAPI (10 μg/ml w 1x PBS). Umyj szkiełka nakrywkowe 3 razy za pomocą 1x PBS, a na koniec zamontuj szkiełka nakrywkowe za pomocą medium montażowego.

5. Kwantyfikacja regeneracji aksonów

UWAGA: Próbki są oznaczane ilościowo pod 40-krotnym obiektywem mikroskopu epifluorescencyjnego. Należy wykonać co najmniej 30 zdjęć na losowych polach, z co najmniej 200 neuronami, które należy określić ilościowo dla każdego leczenia. Każdy eksperyment należy powtórzyć co najmniej trzy razy.

1. Określ ilościowo odsetek neuronów z aksonem (neuryt SMI31 dodatni) w stosunku do całkowitej populacji RGN (zidentyfikowanych z MAP2A/B 514 dodatnim immunobarwieniem ciała neuronalnego i dendrytów).
2. Określ ilościowo wskaźnik regeneracji aksonów lub średnią długość aksonów (μm/neuron). Ten parametr jest zdefiniowany jako suma długości (w μm) wszystkich zidentyfikowanych aksonów, podzielona przez całkowitą liczbę zliczonych neuronów, niezależnie od tego, czy prezentowały one akson, czy nie. Długość aksonów jest określana za pomocą wtyczki NeuronJ oprogramowania do obrazowania ImageJ (NIH-USA).
3. Oblicz średnią, odchylenie standardowe i istotność statystyczną za pomocą odpowiedniego oprogramowania.

Materiały