Obrazowanie komórek przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego odbicia wewnętrznego

Streszczenie

Źródło: Daniele, F., et. al Sondy TIRFM i pH GFP do oceny dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y: obrazowanie komórek i analiza danych. J. Vis. Exp. (2015).

Ten film pokazuje obrazowanie ludzkich komórek nerwiaka zarodkowego przy użyciu mikroskopu całkowitej fluorescencji wewnętrznego odbicia (TIRF) do wizualizacji pęcherzyków synaptycznych znakowanych fluoroforem. Komórki są najpierw skupiane w trybie epifluorescencji. Następnie dokonuje się regulacji, aby uzyskać całkowite odbicie wewnętrzne, generując ulotne fale, które selektywnie wzbudzają fluorofory w pobliżu membrany. Przed obrazowaniem TIRF konfigurowane są parametry akwizycji i ustawiana jest częstotliwość próbkowania.

Protokół

1. Hodowla komórkowa i transfekcja

1. Hodowla komórkowa SH-SY5Y
   UWAGA: Eksperymenty przeprowadzono przy użyciu ludzkiego neuroblastoma SH-SY5Y (ATCC# CRL-2266). Komórki SH-SY5Y rosną jako mieszanina pływających klastrów i komórek przylegających. Postępuj zgodnie z instrukcjami podanymi w protokole (gęstość komórek, współczynnik podziału itp.), aby komórki rosły mocno przymocowane do szklanej pokrywy, co ma kluczowe znaczenie dla mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM).
   1. Przed rozpoczęciem, pod komorą bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym, należy przygotować ....

Wyniki

Rysunek 1. Konfiguracja mikroskopu TIRF. Rozwinięcie i obraz (wstawka) systemu mikroskopowego TIRF. Zestaw składa się z zmotoryzowanego mikroskopu odwróconego Axio Observer Z1 (A), wieloliniowego lasera argonowo-jonowego o mocy 100 mW (B) o.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ekwipunek
Axio Observer Z1	Zeiss	491912-9850-000	Odwrócony microscopehttp://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction
Wieloliniowy laser argonowy Lasos 77	Lasos	00000-1312-752	wieloliniowy (458/488/514 nm), 100mW argon-ion laserhttp://www.lasos.com/products/argon-ion-laser
Laser TIRF slider	Zeiss	423681-9901-000	http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html
100x Cel	Zeiss	421190-9900-000	Oil, NA 1.45 Alpha-Planhttps://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&p=us&f=o&a=v&m=a& id=421190-9900-000&ss=1
Kamera CCD RetigaSRV Fast 1394	QImaging		http://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf
LAMBDA 10-3 zmieniacz filtrów optycznych z SmartShutter	Sutter Instrument Company		http://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html
Software
Oprogramowanie Image ProPlus 6.3	Media Cybernetyka		Wybór miejsca, Wybór ROI, intensywność fluorescencji determinationhttp://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP
Excel	Microsoft		korekcja fotowybielania, analyseshttp://office.microsoft.com/it-it/excel/ całokomórkowe i jednopęcherzykowe
GraphPad Prism 4.00	GraphPad Software, Inc.		statystyczny analysishttp://www.graphpad.com/scientific-software/prism/