Method Article

Obrazowanie komórek przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego odbicia wewnętrznego

June 17th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Źródło: Daniele, F., et. al Sondy TIRFM i pH GFP do oceny dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y: obrazowanie komórek i analiza danych. J. Vis. Exp. (2015).

Ten film pokazuje obrazowanie ludzkich komórek nerwiaka zarodkowego przy użyciu mikroskopu całkowitej fluorescencji wewnętrznego odbicia (TIRF) do wizualizacji pęcherzyków synaptycznych znakowanych fluoroforem. Komórki są najpierw skupiane w trybie epifluorescencji. Następnie dokonuje się regulacji, aby uzyskać całkowite odbicie wewnętrzne, generując ulotne fale, które selektywnie wzbudzają fluorofory w pobliżu membrany. Przed obrazowaniem TIRF konfigurowane są parametry akwizycji i ustawiana jest częstotliwość próbkowania.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla komórkowa i transfekcja

  1. Hodowla komórkowa SH-SY5Y
    UWAGA: Eksperymenty przeprowadzono przy użyciu ludzkiego neuroblastoma SH-SY5Y (ATCC# CRL-2266). Komórki SH-SY5Y rosną jako mieszanina pływających klastrów i komórek przylegających. Postępuj zgodnie z instrukcjami podanymi w protokole (gęstość komórek, współczynnik podziału itp.), aby komórki rosły mocno przymocowane do szklanej pokrywy, co ma kluczowe znaczenie dla mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM).
    1. Przed rozpoczęciem, pod komorą bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym, należy przygotować ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
figure-results-1

Rysunek 1. Konfiguracja mikroskopu TIRF. Rozwinięcie i obraz (wstawka) systemu mikroskopowego TIRF. Zestaw składa się z zmotoryzowanego mikroskopu odwróconego Axio Observer Z1 (A), wieloliniowego lasera argonowo-jonowego o mocy 100 mW (B) o.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ekwipunek
Axio Observer Z1Zeiss491912-9850-000Odwrócony microscopehttp://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction
Wieloliniowy laser argonowy Lasos 77Lasos00000-1312-752wieloliniowy (458/488/514 nm), 100mW argon-ion laserhttp://www.lasos.com/products/argon-ion-laser
Laser TIRF sliderZeiss423681-9901-000http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html
100x CelZeiss421190-9900-000Oil, NA 1.45 Alpha-Planhttps://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&p=us&f=o&a=v&m=a& id=421190-9900-000&ss=1
Kamera CCD RetigaSRV Fast 1394QImaging http://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf
LAMBDA 10-3 zmieniacz filtrów optycznych z SmartShutterSutter Instrument Company http://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html
Software
Oprogramowanie Image ProPlus 6.3Media Cybernetyka Wybór miejsca, Wybór ROI, intensywność fluorescencji determinationhttp://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP
ExcelMicrosoft korekcja fotowybielania, analyseshttp://office.microsoft.com/it-it/excel/ całokomórkowe i jednopęcherzykowe
GraphPad Prism 4.00GraphPad Software, Inc. statystyczny analysishttp://www.graphpad.com/scientific-software/prism/

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Total Internal Reflection FluorescenceTIRF MicroscopyNeuroblastoma CellsSynaptic VesiclesEpifluorescence ModeEvanescent WaveAcquisition SettingsSampling FrequencyFluorophore tagged MembranesCritical Angle Adjustment

Related Articles