Obrazowanie komórek przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego odbicia wewnętrznego

Abstract

Źródło: Daniele, F., et. al Sondy TIRFM i pH GFP do oceny dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y: obrazowanie komórek i analiza danych. J. Vis. Exp. (2015).

Ten film pokazuje obrazowanie ludzkich komórek nerwiaka zarodkowego przy użyciu mikroskopu całkowitej fluorescencji wewnętrznego odbicia (TIRF) do wizualizacji pęcherzyków synaptycznych znakowanych fluoroforem. Komórki są najpierw skupiane w trybie epifluorescencji. Następnie dokonuje się regulacji, aby uzyskać całkowite odbicie wewnętrzne, generując ulotne fale, które selektywnie wzbudzają fluorofory w pobliżu membrany. Przed obrazowaniem TIRF konfigurowane są parametry akwizycji i ustawiana jest częstotliwość próbkowania.

Protocol

1. Hodowla komórkowa i transfekcja

1. Hodowla komórkowa SH-SY5Y
   UWAGA: Eksperymenty przeprowadzono przy użyciu ludzkiego neuroblastoma SH-SY5Y (ATCC# CRL-2266). Komórki SH-SY5Y rosną jako mieszanina pływających klastrów i komórek przylegających. Postępuj zgodnie z instrukcjami podanymi w protokole (gęstość komórek, współczynnik podziału itp.), aby komórki rosły mocno przymocowane do szklanej pokrywy, co ma kluczowe znaczenie dla mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM).
   1. Przed rozpoczęciem, pod komorą bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym, należy przygotować odpowiednią objętość sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforu fosforanowego (PBS) i pożywki hodowlanej.
      1. Przygotować 50 ml PBS o stężeniu 150 mM chlorku sodu (NaCl), 24 mM buforu fosforanowego, pH 7,4. Przefiltruj roztwór.
      2. Przygotuj 50 ml pożywki komórkowej ze zmodyfikowanej pożywki Eagle (DMEM) firmy Dulbecco z wysokospektywną glukozą, 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS), penicyliną (100 U/ml), streptomycyną (100 μg/ml), L-glutaminą (2 mM) i pirogronianem sodu (1 mM). Przefiltruj roztwór.
   2. Usunąć całą pożywkę wzrostową i przemyć komórki 3 ml PBS.
   3. Inkubować komórki z 2 ml 0,05% kwasu trypsynowo-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (dla 6 cm szalki Petriego) przez 5 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO_2, i odłączyć komórki za pomocą pipety.
   4. Dezaktywuj trypsynę, dodając 2 ml DMEM i zbieraj komórki przez wirowanie przy 300 x g przez 5 minut.
   5. Usuń supernatant, dodaj 1 ml DMEM do osadu i pipetuj roztwór w górę iw dół na tyle, aby rozproszyć komórki w zawiesinę jednokomórkową.
   6. Rozdrobnij je w stosunku 1:4 na nowej szalce Petriego o średnicy 6 cm, zawierającej 3 ml kompletnego podłoża. Utrzymywać komórki w kulturze na szalkach Petriego o średnicy 6 cm w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO₂. Subkultura raz w tygodniu lub gdy pokryją 80 - 90% powierzchni.
2. Posiewanie komórek SH-SY5Y do obrazowania
   1. W eksperymentach TIRFM komórki płytkowe umieszcza się na szklanych pokrywach. Zastosuj szklane pokrywy o grubości 0,17 ± 0,005 mm i współczynniku załamania światła 1,5255 ± 0,00015. Przed rozpoczęciem przygotuj szkiełka nakrywkowe w następujący sposób:
      1. Wyczyść szklane pokrywy 90% etanolem przez noc (O/N).
      2. Dokładnie opłucz je w wodzie destylowanej (trzy zmiany wody destylowanej). Suszyć szklane pokrywy w suszarce.
      3. Umieść pokrywki na szklanych szalkach Petriego i sterylizuj w piekarniku nagrzanym do 200 °C przez 3 godziny.
   2. Dzień przed transfekcją umieścić każde szkiełko nakrywkowe na szalce Petriego o średnicy 3,5 cm, dodać 1 ml pożywki hodowlanej i inkubować w temperaturze 37 °C w 5% inkubatorze CO₂.
   3. Trypsynizować komórki zgodnie z opisem w krokach 1.1.3 - 1.1.5, zawiesić osad komórkowy w 1 ml kompletnej pożywki i policzyć. Oblicz odpowiednią objętość zawiesiny komórek, którą należy dodać do każdej szalki Petriego, aby uzyskać 3 x 10 komórek ⁵ komórek/dołek. Ta gęstość jest wymagana do optymalnego wzrostu komórek i wydajnej transfekcji. Inkubować w temperaturze 37 °C w 5% inkubatorze CO₂ O/N.
3. SH-SY5Ytransfekcja przez polietyleniminę (PEI)
   UWAGA: Do wizualizacji dynamiki pęcherzyków synaptycznych użyto wektora pCB6 zawierającego synapto-pHluorynę. Synapto-pHluorin została wytworzona w wyniku fuzji w ramce wrażliwego na pH wariantu białka zielonej fluorescencji (GFP) i białka błony pęcherzykowej synaptobrevin 2. Konstrukt ten został szeroko wykorzystany do zbadania właściwości pęcherzyków synaptycznych w neuronach.
   1. Przed rozpoczęciem transfekcji należy przygotować 10 ml następujących roztworów. Roztwory należy przechowywać maksymalnie przez 1 miesiąc.
      1. Przygotuj roztwór NaCl o stężeniu 150 mM. Doprowadzić do pH 5,5 za pomocą 0,01 N kwasu solnego (HCl).
      2. Przygotować roztwór PEI o stężeniu 10% polietyleneniny (PEI; 25 kDa liniowo) w 150 mM roztworze NaCl. pH roztworu wzrasta do 8,8. Dostosuj pH do 7,8 za pomocą 0,01 N HCl.
   2. 24 godziny po posianiu, usunąć pożywkę i odświeżyć 1,5 ml kompletnej pożywki. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO₂.
   3. Pod komorą bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym, w probówce do mikrofugi o pojemności 1,5 ml, dodać 3 μg plazmidowego DNA do 25 μl 150 mM roztworu NaCl i 100 μl roztworu PEI na 3,5 cm szalkę Petriego.
   4. Wirować przez 10 sekund, a następnie inkubować mieszaninę DNA/PEI przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT).
   5. Ostrożnie dodać mieszaninę DNA/PEI do szalki Petriego zawierającej szkiełka nakrywkowe z komórkami i delikatnie wstrząsnąć, aby równomiernie rozprowadzić odczynnik na szalce Petriego.
   6. Po 4 godzinach zmienić podłoże i inkubować komórki O/N w temperaturze 37 °C w 5% inkubatorze CO₂. Eksperymenty obrazowe należy wykonywać 24 - 48 godzin po transfekcji.

2. Obrazowanie komórek za pomocą TIRFM

1. Konfiguracja obrazowania
   1. Wykonaj obrazowanie TIRF za pomocą konfiguracji opisanej w Rysunek 1. Składa się z odwróconego mikroskopu z napędem silnikowym (Rysunek 1, wstawka A), źródła laserowego (Rysunek 1, wstawka B) oraz suwaka TIRF (Rysunek 1, wstawka C). Osiągnij oświetlenie TIRFM dzięki wysokiej aperturze numerycznej (NA 1.45 Alpha Plan-Fluar) 100-krotny olejek, obiektyw immersyjny.
   2. Do oświetlenia TIRFM należy użyć wieloliniowego (458/488/514 nm) lasera argonowo-jonowego o mocy 100 mW. Za pomocą światłowodu jednomodowego wprowadź liniowo spolaryzowane światło laserowe na ścieżkę wiązki za pomocą suwaka TIRF. Włóż suwak TIRF do płaszczyzny przysłony pola świetlnego na ścieżce wiązki światła odbitego.
      1. Aby uzyskać oświetlenie o szerokim polu widzenia, podłącz mikroskop do konwencjonalnej rtęciowej lampy o krótkim łuku HBO o białym świetle. Podwójny pryzmat utrzymujący polaryzację w suwaku zapewnia jednoczesne połączenie oświetlenia TIRF i światła białego.
   3. Przefiltrować światło lasera za pomocą filtra wzbudzającego (szerokość pasma 488/10 nm) zamontowanego na kole filtrowym i wprowadzonego na ścieżkę lasera. Zastosuj szybką, sterowaną programowo migawkę, aby umożliwić szybkie sterowanie oświetleniem laserowym. Do analizy pHluorin należy zamontować filtr emisyjny pasmowoprzepustowy 525/50 nm. Rejestruj obrazy cyfrowe (512 x 512 pikseli) za pomocą chłodzonej szybkiej kamery CCD za pomocą oprogramowania Image ProPlus.
2. Osiąganie oświetlenia TIRF (Rysunek 2)
   1. Włącz lasery, komputer, kamerę, koło filtrów i kontrolery migawki; Następnie odczekaj 20 minut przed rozpoczęciem eksperymentu, ponieważ lasery muszą się rozgrzać i ustabilizować.
   2. Przed obrazowaniem dokonaj odpowiedniej objętości następujących rozwiązań.
      1. Przygotować 50 ml roztworu Krebsa (KRH) w 125 mM NaCl, 5 mM chlorku potasu (KCl), 1,2 mM siarczanu magnezu (MgSO₄), 1,2 mM diwodorofosforanu potasu (KH₂PO₄), 25 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowego (HEPES) (buforowanego do pH 7,4), 2 mM chlorku wapnia (CaCl₂), i 6 mM glukozy.
      2. Przygotować 10 ml roztworu KCl-KRH (pH 7,4) przy 80 mM NaCl, 50 mM KCl, 1,2 mM MgSO₄, 1,2 mM KH₂PO₄, 25 mM HEPES (buforowane do pH 7,4), 2 mM CaCl₂ i 6 mM glukozy.
   3. Zdejmij szklaną pokrywę z transfekowanymi komórkami i włóż ją do odpowiedniej komory obrazowania. Zmontuj komorę i dodaj 500 μl roztworu KRH na środek szklanki.
   4. Dodaj olej na obiektyw. Umieść komorę obrazowania na stoliku mikroskopu i umieść obiektyw pod szklanym szkiełkiem nakrywkowym. Umieść bezpieczną pokrywę nad próbką.
   5. W trybie epifluorescencji skup się na szkiełku nakrywkowym (górna powierzchnia) i wybierz transfekowane komórki umieszczone w środku komory. Wybierz komórki, których sygnał fluorescencyjny może być wyraźnie zarejestrowany przy czasie naświetlania poniżej 80 ms.
   6. Pod kontrolą oprogramowania przełącz na oświetlenie TIRF w trybie na żywo.
   7. Aby ustawić konfigurację TIRF, sprawdź położenie wiązki wychodzącej z obiektywu na pokrywie próbki (Rysunek 2B). Gdy wiązka jest umieszczona w środku soczewki obiektywu (Rysunek 2A, po lewej), plamka jest widoczna w środku pokrywy próbki TIRF (Rysunek 2B, po lewej), a komórka jest obrazowana w trybie epifluorescencji (kilka płaszczyzn ostrości, wysoka fluorescencja tła; Rysunek 2C, po lewej).
   8. Aby osiągnąć kąt krytyczny, przesuń skupione miejsce w kierunku Y (do przodu lub do tyłu; Rysunek 2B, w środku) za pomocą śruby regulacji kąta na suwaku TIRF (Rysunek 1C). Kiedy wiązka zbiega się na płaszczyźnie próbki pod kątem większym niż kąt krytyczny (Rysunek 2A, po prawej), plamka znika, a na środku okładki próbki widoczna jest prosta, cienka, skupiona linia (Rysunek 2B, po prawej).
   9. Aby dostroić kąt TIRF, użyj próbki komórki (Rysunek 2C). Obejrzyj obraz fluorescencji na filmie. Na tym etapie nadal widoczny jest obraz podobny do epifluorescencji. Delikatnie przesuwaj śrubę, aż zostanie osiągnięty warunek TIRF: tylko jedna płaszczyzna optyczna komórki jest zogniskowana (tj. błona plazmatyczna stykająca się ze szkiełkiem nakrywkowym). W ten sposób powstaje płaski obraz o wysokim kontraście (Rysunek 2C, po prawej).
3. Przykładowe obrazowanie
   1. Ustaw jednokanałowy eksperyment poklatkowy. Aby zminimalizować fotowybielanie, uchwyć obraz przy użyciu krótkiego czasu naświetlania i wysokiego wzmocnienia. Odpowiednie czasy naświetlania wynoszą od 40 do 80 ms. Rejestruj obrazy z częstotliwością próbkowania 1 - 2 Hz. Kinetyka pęcherzyków może być lepiej doceniana przy próbkowaniu przy wyższej częstotliwości (10 Hz). Regularny czas obserwacji to zwykle 2 min.

Results

Rysunek 1. Konfiguracja mikroskopu TIRF. Rozwinięcie i obraz (wstawka) systemu mikroskopowego TIRF. Zestaw składa się z zmotoryzowanego mikroskopu odwróconego Axio Observer Z1 (A), wieloliniowego lasera argonowo-jonowego o mocy 100 mW (B) o...

Materials