Mikroskopia fluorescencyjna całkowitego odbicia wewnętrznego do wizualizacji zdarzeń egzocytarnych

Streszczenie

Źródło: Winkle, C. C., et al. Wykorzystanie połączonych metodologii w celu zdefiniowania roli dostarczania błony plazmatycznej podczas rozgałęziania aksonów i morfogenezy neuronów. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film przedstawia mikroskopię fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) do wizualizacji zdarzeń egzocytarnych w neuronach korowych. Wrażliwy na pH marker białka zielonej fluorescencji (GFP) fluoryzuje po fuzji pęcherzyków, z selektywnym wzbudzeniem TIRF wychwytującym egzocytozę błonowo-proksymalną w obrazowaniu poklatkowym.

Protokół

1. Obrazowanie zdarzeń egzocytarnych za pomocą mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Uwaga: Protokół ten wymaga specjalistycznego sprzętu mikroskopowego, w tym komory środowiskowej do utrzymywania temperatury, wilgotności i dwutlenku węgla (CO₂), mikroskopu fluorescencji z odwróconym całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF) wyposażonego w oświetlenie epifluorescencyjne, obiektyw TIRF o dużym powiększeniu / dużej aperturze numerycznej (NA), zautomatyzowany XYZ stopień i czuły detektor urządzenia sprzężonego z ładunkiem (CCD). Protokół ten wykorzystuje w pełni zautomatyzowany mikroskop odwrócony wyposażony w obiektyw 100x 1,49 NA TIRF, laser półprzewodnikowy 491 nm i CCD ZWIELOKROTNIAJĄCY ELEKTRONY (EM-CCD). Wszystkie urządzenia są sterowane za pomocą oprogramowania do obrazowania i sterowania laserem. Przed rozpoczęciem protokołu obrazowania włącz komorę środowiskową, scenę, lampę, komputer i kamerę.

1. Wybierz obiektyw w oprogramowaniu do obrazowania. Po umieszczeniu obiektywu na miejscu przymocuj grzałkę obiektywu do kołnierza.
2. Upewnij się, że cel jest całkowicie opuszczony przed zamocowaniem inkubatora etapowego w szczelinie stopnia. Wlej równomiernie wodę destylowaną do wlotów inkubatora stopniowego, aby zapobiec rozlaniu.
3. Włącz system inkubacji. Otwórz zawór do zbiornika CO₂ i upewnij się, że ciśnienie jest odpowiednie dla systemu zgodnie z instrukcjami producenta. Odczekać, aż komora osiągnie 5% CO₂ i 37 °C. Przed dodaniem naczynia do obrazowania umieść pustą miskę w inkubatorze, aby uniknąć kondensacji wody na obiektywie.
4. Włącz źródło lasera.
5. Otwórz inkubator i dodaj olejek immersyjny do soczewki. Umieścić próbkę w inkubatorze i ustabilizować ją za pomocą ramion stabilizujących lub obciążnika szalkowego. Podnieś obiektyw do momentu, aż olej zetknie się z dnem próbki. Przełącz się na oświetlenie światłem przechodzącym i znajdź neuronalną płaszczyznę ogniskową przez okulary.
6. Uruchom oprogramowanie lasera i podłącz je do oprogramowania sterującego laserem. Ustaw oświetlenie na szerokie pole i wybierz obiektyw (zalecane jest 100x 1,49 NA TIRF). Ustaw współczynnik załamania światła próbki (komórki ~1,38). Dostosuj intensywność lasera, odznaczając "TTL" (logika tranzystor-tranzystor) dla lasera 491 nm. Ustaw suwak w pozycji 100, a następnie zmniejsz go z powrotem do wartości z zakresu od 20% do 40%. Ponownie sprawdź "TTL".
7. Ponownie ustaw ostrość na próbce w oświetleniu światłem przechodzącym. Przejdź do oprogramowania do obrazowania, wybierz oświetlenie laserowe 491 nm i otwórz migawkę. Precyzyjnie wyreguluj ogniskową lasera na suficie i wyśrodkuj go do środka membrany w polu zamkniętym z usuniętym kondensatorem. Umieść kondensator do góry nogami na stole optycznym, aby nie porysować obiektywu.
8. Wymień kondensator, przejdź do oprogramowania TIRF i ustaw głębokość penetracji (PD) na 110 nm. Następnie przełącz się z oświetlenia szerokokątnego na tryb oświetlenia TIRF w celu obrazowania.
9. Znajdź komórki wyrażające fluorynę w białku błonowym 2 (VAMP2) związanym z pęcherzykami przez okulary za pomocą epifluorescencji szerokokątnej ze źródłem światła epifluorescencyjnego.
   1. Dostosuj parametry obrazowania (czas ekspozycji, wzmocnienie i moc lasera), aby zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu i zakres dynamiczny, używając minimalnego czasu ekspozycji i intensywności lasera, aby zredukować fotowybielanie i fototoksyczność (na przykład, ekspozycja między 50 - 100 ms, z 15 - 30 wzmocnieniem przy 30% maksymalnej mocy lasera).
   2. Ustaw ciągły autofokus na komórkę. Uzyskaj zestaw zdjęć poklatkowych z akwizycją odbywającą się co 0,5 sekundy przez 5 minut. W przypadku stanu stymulowanego netryną-1 dodać 500 ng/ml netryny-1 do naczynia z komórkami w kapturze z przepływem laminarnym i umieścić naczynie z powrotem w inkubatorze na 1 godzinę przed obrazowaniem.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
35mm szklane dno naczynia do obrazowania na żywo komórek	Matek Corporation	p356-1.5-14-C	Muszą być pokryte 1mg/mL poli-D-lizyną i przepłukane przed posiewem komórek
Mikroskop odwrócony Olympus IX81-ZDC2	Olympus
Lampa ksenonowa Lambda LS	Firma Sutter Instruments Środowiskowy
inkubator górny	Tokai Hit
100x 1,49 NA Obiektyw TIRF	Olympus
Andor iXon EM-CCD	Andor
Cell Oprogramowanie sterujące TIRF	Olympus		Software używane do sterowania lasery do obrazowania TIRF
Fidżi (zdjęcie J)	NIH	ImageJ wersja 1.49t
Królik poliklonalny anty-ludzki VAMP2	Sygnalizacja komórkowa	11829
Poli-D-lizyna	Sigma	p-7886	Rozpuszczony w sterylnej wodzie w stężeniu 1 mg / ml