Artykuł metodologiczny

Koncentracja metabolitów z planktonicznych zbiorowisk o niskiej gęstości do metabolomiki środowiskowej z wykorzystaniem spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego

DOI:

10.3791/3163

⸱

7 kwietnia 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Biosphere Oriented Biology Research Unit, RIKEN Advanced Science Institute, 2Graduate School of Nanobioscience, Yokohama City University, 3Advanced NMR Metabomics Research Team, RIKEN Plant Science Center, 4Graduate School of Bioagricultural Science, Nagoya University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono metodę ekstrakcji metabolitów z planktonicznych społeczności drobnoustrojów. Pobieranie próbek całej społeczności realizowane jest poprzez filtrację na specjalnie przygotowanych filtrach. Po liofilizacji ekstrahowane są metabolity rozpuszczalne w wodzie. Podejście to umożliwia zastosowanie metabolomiki środowiskowej w badaniach trans-omicznych naturalnych lub eksperymentalnych społeczności drobnoustrojów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metabolomika środowiskowa to rozwijająca się dziedzina, która pozwala na nowe zrozumienie sposobów, w jakie organizmy reagują i oddziałują ze środowiskiem oraz ze sobą nawzajem na poziomie biochemicznym1. Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) jest jedną z kilku technologii, obok chromatografii gazowej sprzężonej z spektrometrią mas (GC-MS), wykazującą znaczny potencjał w tego typu badaniach. Zaletą NMR jest jego przydatność do analiz nietargetowanych, dostarczanie informacji strukturalnych oraz możliwość ilościowego i statystycznego analizowania widm w oparciu o niedawno udostępnione bazy danych widm poszczególnych metabolitów2,3. Ponadto dane spektralne NMR można łączyć z danymi z innych poziomów omicznych (np. transkryptomiki, genomiki), aby uzyskać bardziej kompleksowe zrozumienie odpowiedzi fizjologicznych taksonów na oddziaływania między nimi oraz ze środowiskiem4,5,6. Jednak NMR jest mniej czuły niż inne techniki metabolomiczne, co utrudnia jego zastosowanie w naturalnych układach mikrobiologicznych, w których populacje próbek mogą być rzadkie, a stężenia metabolitów niskie w porównaniu do metabolitów pochodzących z dobrze zdefiniowanych i łatwo ekstrahowalnych źródeł, takich jak całe tkanki, płyny ustrojowe czy hodowle komórkowe. W konsekwencji nieliczne przeprowadzone do tej pory bezpośrednie badania metabolomiczne mikroorganizmów środowiskowych ograniczały się do ekosystemów opartych na hodowlach lub łatwo zdefiniowanych układów o wysokiej gęstości, takich jak systemy gospodarz-symbiont, skonstruowane kokultury lub manipulacje środowiskiem jelitowym, gdzie dodatkowo można zastosować znakowanie izotopami stabilnymi w celu wzmocnienia sygnałów NMR7,8,9,10,11,12. Brakuje metod ułatwiających zagęszczanie i gromadzenie metabolitów środowiskowych do stężeń odpowiednich dla NMR. Ponieważ w ostatnim czasie zwrócono uwagę na metabolomikę środowiskową organizmów w środowisku wodnym, gdzie znaczna część przepływu energii i materii jest mediowana przez społeczność planktonową13,14, opracowaliśmy metodę zagęszczania i ekstrakcji metabolitów całej społeczności z planktonicznych układów mikrobiologicznych poprzez filtrację. Komercyjnie dostępne hydrofilowe filtry z poli-1,1-difluoroetylenu (PVDF) są specjalnie traktowane w celu całkowitego usunięcia substancji ekstrahowalnych, które w przeciwnym razie mogłyby pojawić się jako zanieczyszczenia w późniejszych analizach. Przetraktowane filtry są następnie wykorzystywane do filtrowania badanych próbek środowiskowych lub eksperymentalnych. Filtry zawierające wilgotny materiał próbkowy są liofilizowane, a metabolity rozpuszczalne w wodzie są ekstrahowane bezpośrednio do konwencjonalnej spektroskopii NMR przy użyciu zestandaryzowanego buforu ekstrakcyjnego fosforanu potasu2. Dane uzyskane za pomocą tych metod mogą być analizowane statystycznie w celu zidentyfikowania istotnych wzorców lub integrowane z innymi poziomami omicznymi dla kompleksowego zrozumienia funkcjonowania społeczności i ekosystemu.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie filtra w celu usunięcia substancji ekstrahowalnych

  1. Użyć hydrofilowych filtrów Durapore PVDF o średnicy 25 mm i wielkości porów 0,22 μm (Millipore). Za pomocą pęsety umieścić filtry w czystym zlewce Pyrex o pojemności 500 ml. Przepłukać trzy razy wodą destylowaną. Podczas płukania energicznie mieszać zawartość, aby zapobiec przyklejaniu się filtrów do siebie. Dodać 300 ml wody Milli-Q (Millipore) lub równoważnej wody wysokiej jakości. Poddać autoklawowaniu, aby ułatwić całkowite usunięcie substancji ekstrahowalnych z filtrów.
  2. Odlać wodę Milli-Q i ponownie trzykrotnie przepłukać filtry, tym razem wodą Milli-Q. Za pomocą pęsety umieścić poszczególne filtry na czystej, suchej powierzchni (np. folii aluminiowej) i wysuszyć w odpowiedniej temperaturze (np. 37 °C) lub pozostawić do wyschnięcia na powietrzu. Filtry są teraz gotowe do użycia.

2. Filtracja materiału próbki

  1. W celu zaprezentowania niniejszego protokołu użyto stalowej rozdzielni filtracyjnej Millipore z 3 gniazdami, kolumn filtracyjnych do mikroanalizy o średnicy 25 mm ze szklanymi podkładkami oraz pompy mechanicznej. Stosując technikę aseptyczną, umieść pojedynczy filtr 25 mm na podstawie kolumny filtracyjnej, nałóż kolumnę i zaciśnij zaciskiem.
  2. Nalej 15 ml próbki do kolumny, otwórz zawór odcinający w rozdzielni filtracyjnej i włącz pompę. Filtruj pod niewielkim ciśnieniem, aby zminimalizować rozrywanie komórek (<5 kPa). Do tego protokołu można dostosować inne pompy, np. ręczną lub perystaltyczną. W przypadku próbek o mniejszej gęstości może być konieczne sukcesywne dodawanie wody; nie dopuszczaj do wyschnięcia filtra przez dłuższy czas pomiędzy kolejnymi dodaniami wody.
  3. W przypadku próbek morskich, po przefiltrowaniu próbki, można przeprowadzić opcjonalne płukanie wodą słodką w celu zmniejszenia ilości pozostałych jonów paramagnetycznych w próbce i na filtrze. Może to pomóc w bardziej precyzyjnym dostrojeniu magnesu spektrometru. Wystarczy delikatnie dodać niewielką objętość wody i przefiltrować ją przez zebraną próbkę na koniec procesu.
  4. Po zakończeniu filtrowania wyłącz pompę i pozostaw zawór otwarty, aby pod filtrem utrzymywało się podciśnienie. Zdejmij zacisk i kolumnę filtracyjną.
  5. Używając jednej ręki i czystej pęsety, chwyć filtr. Złóż filtr na pół, uważając, aby nie stworzyć ostrego zagięcia. Drugą ręką wykorzystaj krawędź sterylnej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2 ml, aby przytrzymać filtr. Puść pęsetę, a następnie użyj jej, aby ponownie chwycić obie krawędzie filtra. Chwyć je pod kątem 45 ° względem zagięcia.
  6. Włóż filtr do probówki 2 ml i puść go, tak aby rozłożył się stroną z próbką do wewnątrz. W ten sposób do sterylnej probówki do mikrocentryfugi 2 ml można umieścić maksymalnie dwa filtry. W przypadku stosowania dwóch filtrów upewnij się, że nakładają się one w minimalnym stopniu. Natychmiast zamroź (co najmniej -30 °C).

3. Ekstrakcja metabolitów rozpuszczalnych w wodzie

  1. Liofilizuj próbki przez noc lub przez co najmniej 10 godzin.
  2. Po liofilizacji do każdej probówki dodaj stalowy kruszywo (Tokken). Dodaj 750 μl zestandaryzowanego buforu NMR fosforanowego potasu w tlenku deuteru (2H > 90%) ze standardem 2,2-dimetylopentan-5-sulfonianem-2-silowym (DSS) (KPi; 38,3 mM KH2PO4, 61,7 mM K2HPO4, DSS 0,1 mM, pH 7,0, 90% D2O)2.
  3. Sonicuj próbki przez 5 minut w temperaturze 4 °C w sonikatorze wodnym (Bioruptor, Diagenode), aby usunąć materiał komórkowy z filtra. Wyjmij filtry za pomocą czystej pęsety.
  4. Rozbij komórki za pomocą kruszarki młynkowej (1600 rpm) przez 5 minut.
  5. Inkubuj w temperaturze 65 °C z wstrząsaniem (1400 rpm) na wytrząsarce laboratoryjnej (Eppendorf) przez 15 minut.
  6. Usuń metalowe kruszywo za pomocą czystej pęsety i odwiruj próbkę przy 13 000 g przez 5 minut.
  7. Pobierz nadsącz bezpośrednio do probówki NMR do spektroskopii NMR.

4. Spektroskopia NMR i analiza danych

  1. Wprowadź próbkę do spektrometru NMR (w tym przypadku spektrometru Bruker DRX-500 wyposażonego w sondę TXI z gradientem trójosiowym sterowanym przez komputer z oprogramowaniem XWIN-NMR).
  2. Uzyskaj jednowymiarowe (1D) widma 1H NMR, korzystając z interfejsu XWIN-NMR i stosując odpowiednie, wcześniej opublikowane metody2,15. W niniejszym badaniu widma 1H NMR rejestrowano na spektrometrze DRX-500 pracującym z częstotliwością 500,03 MHz w temperaturze 298 K. Sygnały pozostałej wody tłumiono za pomocą sekwencji impulsów Watergate przy czasie repetycji 1,2 s. Zebrano 128 przechyłów, aby uzyskać 32 000 punktów danych na widmo.
  3. Przenieś katalogi z danymi NMR na komputer z zainstalowanym oprogramowaniem NMRPipe16. Przetwórz surowe dane, ustawiając DSS jako referencję 0 ppm, a następnie przeprowadź manualne korygowanie fazy widm. Zdigitalizuj dane widmowe do postaci zestawu wartości dyskretnych poprzez ich całkowanie lub „binowanie” przy użyciu oprogramowania takiego jak rNMR, Automics lub ogólnodostępnego pakietu FT2B ze strony internetowej ECOMICS (https://database.riken.jp/ecomics/)3,17. W tym przykładzie widma całkowano w zakresie od 0,5 do 10,5 ppm w regionach całkowania o szerokości 0,032 ppm przy użyciu ECOMICS, a następnie znormalizowano je względem DSS lub całkowitej intensywności sygnału. Uzyskane dane mogą teraz zostać wykorzystane do dalszych analiz statystycznych, takich jak analiza głównych składowych (PCA), przy użyciu bezpłatnych pakietów oprogramowania, np. R18.

5. Reprezentatywne wyniki

Przykład widm 1H NMR uzyskanych za pomocą opisanych metod przedstawiono na Rysunku 1. Próbki te, pobrane z dwóch punktów czasowych eksperymentu w mikrokosmosie, wykazują wyraźne różnice wynikające z aktywności metabolicznej glonów. Widmo z 4. dnia wykazuje znacznie większą liczbę pikuów, szczególnie w zakresie 3-4 ppm, w porównaniu z próbką z 1. dnia. Piki te można przypisać cukrom wytwarzanym przez zakwitające okrzemki wewnątrz mikrokosmosu. W podobnym eksperymencie, w którym porównywano wzrost naturalnych społeczności planktonowych w sztucznej lub naturalnej wodzie morskiej, podejścia statystyczne, takie jak wykres wyników analizy głównych składowych (PCA) wyprowadzony z pogrupowanych widm NMR, mogą być wykorzystane do wykazania wyraźnych różnic metabolicznych między dwiema grupami (Rys. 2), natomiast wykresy ładunków pozwalają zidentyfikować piki w widmach, które kształtują rozkład danych. Takie wyniki można porównać z danymi z innych poziomów omiki, np. z metod genomowego fingerprintingu (Rys. 3). Piki NMR te można sprawdzać indywidualnie (np. w bazie BMRB; http://www.bmrb.wisc.edu/)19, lub statystycznie analizować całe widma (np. za pomocą SpinAssign pod adresem http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search)2. W tym przykładzie różnice między grupami wynikały z obfitości pikuów w regionie cukrów (3,39 ppm do 4,04 ppm) w widmach metabolitów naturalnej społeczności planktonowej, natomiast kilka pikuów charakterystycznych dla społeczności w sztucznej wodzie morskiej zostało wstępnie zidentyfikowanych jako mleczan i mrówczan przy użyciu SpinAssign.

figure-protocol-1
Rysunek 1. Reprezentatywne widma 1H NMR uzyskane z próbek przetworzonych zgodnie z niniejszą procedurą. Próbki z mikrokosmosów pobrano przed (dzień 1) i w trakcie (dzień 4) intensywnego zakwitu okrzemków. Eksperymenty NMR przeprowadzono na spektrometrze Bruker DRX-500, a sygnały znormalizowano do wysokości piku standardu wewnętrznego (DSS; 0 ppm).

figure-protocol-2
Rycina 2. Wykres wyników analizy głównych składowych (PCA) dla pogrupowanych widm NMR metabolomów pochodzenia naturalnego z planktonicznych społeczności mikrobiologicznych hodowanych w mikrokosmosach z naturalną (otwarte romby) lub sztuczną (czarne koła) wodą morską. Na wykresie rozrzutu można zaobserwować wyraźne różnice metaboliczne. Wykres ładunków z takiej analizy może następnie posłużyć do zidentyfikowania istotnych, charakterystycznych pików w systemie; piki te mogą być w razie potrzeby poddane dalszej analizie.

figure-protocol-3
Rysunek 3. Przykład analizy multiomicznej łączącej NMR z danymi genomicznymi. Skład wspólnoty oparty na elektroforezie w żelu z gradientem denaturującym genów 18S (po lewej) i 16S (po prawej) rRNA z tych samych próbek, które analizowano na Rysunku 2, wykazuje również wyraźne różnice w strukturze wspólnoty mikrobiologicznej między naturalnymi (puste romby) a sztucznymi (czarne koła) mikrokosmosami wody morskiej. Taka zgodność między metabolomem a genomem w systemach naturalnych wykazuje użyteczność tego podejścia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiona tutaj metoda filtracji i ekstrakcji metabolitów pozwala na zgromadzenie biomasy planktonicznej mikroorganizmów w ilości wystarczającej do analizy metabolomicznej NMR. Choć zaprezentowano jedynie ekstrakcję metabolitów rozpuszczalnych w wodzie przy użyciu KPi oraz 1D 1H NMR, możliwe jest zastosowanie innych rozpuszczalników ekstrakcyjnych i podejść spektroskopowych. Przydatnym przykładem jest użycie deuterowanego metanolu jako rozpuszczalnika półpolarnego, który – jak wykazano – pozwala na uzyskan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania te były częściowo wspierane przez granty na badania naukowe w ramach ambitnych badań eksploracyjnych (J.K.) oraz badań naukowych (A) (J.K. i S.M.) przyznane przez Ministerstwo Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii Japonii. Dodatkowe wsparcie zapewniło stypendium RIKEN FPR (R.C.E.). Autorzy wyrażają wdzięczność dr. Eisuke Chikayamie, dr Yasuyo Sekiyamie i dr Mami Okamoto za pomoc techniczną przy analizach NMR i analizach statystycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Hydrofilowe filtry Durapore PVDF 0,22 μm, 25 mmEMD MilliporeGVWP02500
Uchwyt do filtrów do mikroanaliz, 25 mm, z podkładką ze spiekanego szkłaEMD MilliporeXX1002500
Kolektor 3-miejscowy, 47 mm, ze stali nierdzewnejEMD MilliporeXX2504735
KH2PO4Wako Pure Chemical Industries, Ltd.169-04245
K2HPO4Wako Pure Chemical Industries, Ltd.164-04295
Tlenek deuteru, 2H > 90%Campridge Isotope LaboratotiesDLM-4
DSSFluka92754
AutomillTokkenTK-AM4W zestawie kruszarki ze stali nierdzewnej
Thermomixer comfortEppendorf5355 000.011
BioruptorDiagenodeUCD-200
Odparowarka próżniowaEYELACVE-3100
NMRBruker CorporationDRX-500 z sondą 5 mm-TXI
Narzędzie do binningu widmaWłasne opracowanieFT2DBhttps://database.riken.jp/ecomics/
Narzędzie do adnotacji i baza danych metabolitówWłasne opracowanieSpinAssignhttp://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bundy, J. G., Davey, M. P., Viant, M. R. Environmental metabolomics: a critical review and future perspectives. Metabolomics. 5, 3-21 (2008).
  2. Chikayama, E., et al. Statistical indices for simultaneous large-scale metabolite detections for a single NMR spectrum. Anal. Chem. 82, 1653-1658 (2010).
  3. Lewis, I. A., Schommer, S. C., Markley, J. L. rNMR: open source software for identifying and quantifying metabolites in NMR spectra. Magn. Reson. Chem. 47, S123-S126 (2009).
  4. Li, M., et al. Symbiotic gut microbes modulate human metabolic phenotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2117-2122 (2008).
  5. Mochida, K., Furuta, T., Ebana, K., Shinozaki, K., Kikuchi, J. Correlation exploration of metabolic and genomic diversity in rice. BMC Genomics. 10, 568(2009).
  6. Fukuda, S., et al. Bifidobacteria can protect from enteropathogenic infection through production of acetate. Nature. 469, 543-547 (2011).
  7. Kikuchi, J., Hirayama, T. Practical aspects of stable isotope labeling of higher plants for a hetero-nuclear multi-dimensional NMR-based metabolomics. Methods Mol. Biol. 358, 273-286 (2007).
  8. Martin, F. P., et al. A top-down systems biology view of microbiome-mammalian metabolic interactions in a mouse model. Mol. Syst. Biol. 3, 112(2007).
  9. Mahrous, E. A., Lee, R. B., Lee, R. E. A rapid approach to lipid profiling of mycobacteria using 2D HSQC NMR maps. J. Lipid Res. 49, 455-463 (2008).
  10. Fukuda, S., et al. Evaluation and characterization of bacterial metabolic dynamics with a novel profiling technique, real-time metabolotyping. PloS ONE. 4, e4893(2009).
  11. Date, Y., et al. New monitoring approach for metabolic dynamics in microbial ecosystems using stable-isotope-labeling technologies. J. Biosci. Bioeng. 110, 87-93 (2010).
  12. Nakanishi, Y., et al. Dynamic omics approach identifies nutrition-mediated microbial interactions. J. Proteome Res. 10, 824-836 (2011).
  13. Falkowski, P., Barber, R., Smetacek, V. Biogeochemical controls and feedbacks on ocean primary production. Science. 281, 200-207 (1998).
  14. Viant, M. R. Metabolomics of aquatic organisms: the new 'omics' on the block. Mar. Ecol. Prog. Ser. 332, 301-306 (2007).
  15. Sekiyama, Y., Chikayama, E., Kikuchi, J. Evaluation of a semipolar solvent system as a step toward heteronuclear multidimensional NMR-based metabolomics for 13C-labeled bacteria, plants, and animals. Anal. Chem. 83, 719-726 (2011).
  16. Delaglio, F., et al. NMRPipe: A multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J. Biomol. NMR. 6, 277-293 (1995).
  17. Wang, T., et al. Automics: an integrated platform for NMR-based metabonomics spectral processing and data analysis. BMC Bioinformatics. 10, 83(2009).
  18. The R Project for Statistical Computing. , Available from: http://www.r-project.org/ (2010).
  19. Eldon, L., et al. BioMagResBank. Nucleic Acids Res. 36, D402-D408 (2007).
  20. Sekiyama, Y., Chikayama, E., Kikuchi, J. Profiling polar and semipolar plant metabolites throughout extraction processes using a combined solution-state and high-resolution magic angle spinning NMR approach. Anal. Chem. 82, 1643-1652 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

St enie metabolit wmetoda filtracjiekstrakcja liofilizacyjnabufor fosforan potasuanaliza widm NMRstatystyczna analiza PCAintegracja multiomiczna

Powiązane artykuły