Hamowanie aktywności neuronalnej i jej wykrywanie za pomocą elektrofizjologii u szczura

Streszczenie

Źródło: Lai, J., et al. Jednoczesny zapis elektrofizjologiczny i mikroiniekcje środków hamujących do mózgu gryzonia. J. Vis. Exp. (2015)

Ten film demonstruje technikę opartą na mikroiniekcjach do jednoczesnego rejestrowania i hamowania neuronów w wzgórku górnym szczura. Procedura obejmuje celowanie stereotaktyczne, wiercenie czaszki i wprowadzenie iniekrody, która dostarcza neuroprzekaźnik hamujący, jednocześnie rejestrując aktywność neuronów. Stymulacja światłem wywołuje potencjały czynnościowe, podczas gdy mikroiniekcja leków hamuje pobudliwość neuronów. Wraz ze spadkiem poziomu neuroprzekaźników aktywność neuronalna powraca do wartości wyjściowej, umożliwiając badanie zarówno hamowania, jak i odzyskiwania.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Montaż pipety rejestrująco-iniekcyjnej

1. Wyciągnąć szklaną kapilarnę o długości około 7 cm (średnica zewnętrzna 1 mm) za pomocą ściągacza do pipet.
2. Przełam końcówkę kapilary i sprawdź otwór pod mikroskopem świetlnym. Upewnij się, że średnica wewnętrzna wynosi od 30 μm do 40 μm.
3. Włóż srebrny drut o długości 7 cm do szklanej kapilary tak, aby około 1 cm wystawał z niestożkowego końca szklanej pipety.
4. Zegnij nadmiar filamentu prostopadle do szklanej kapilary.
5. Nałożyć kroplę elastycznego kleju z tworzywa sztucznego na trzon igły podskórnej o sile 30 G.
6. Wprowadzić igłę podskórną o sile 30 G do szklanej pipety zgodnie ze schematem przedstawionym na rysunku 1.
7. Dodaj drugą warstwę kleju, aby zapewnić prawidłowe uszczelnienie od połączenia szklanej pipety z igłą podskórną.
8. Pozostaw pipetę do wyschnięcia z końcówką skierowaną do góry na około 12 godzin, aby zapewnić prawidłowe utwardzenie kleju. Końcowy wynik pokazano na rysunku 2.

UWAGA: Ta procedura jest wykonywana w przypadku ostrych eksperymentów i sterylizacja końcówki pipety nie jest wymagana.

2. Przygotowanie zwierząt

1. Umieść szczura w pudełku anestezjologicznym.
2. Wywołaj znieczulenie za pomocą 4% izofluranu przez 5 do 10 minut.
3. Umieść zwierzę na stole stereotaktycznym z poduszką grzewczą i sondą doodbytniczą, aby utrzymać temperaturę ciała 37 °C. Użyj stożka nosowego, aby utrzymać znieczulenie 2% izofluranem. Zabezpiecz głowę szczura za pomocą nauszników i uchwytu na zęby.
4. Zastosuj maść okulistyczną lub krople do oczu, które zawierają 1% kropli atropiny, aby pomóc w rozszerzeniu źrenic. Aby zapobiec wysuszeniu, należy stosować krople smarujące mniej więcej co 30 minut.
5. Ogol głowę i oczyść ją 10% jodowidonem.
6. W celu znieczulenia miejscowego wstrzyknij 0,5 ml 2% lidokainy pod skórę głowy w 2-3 miejscach, unosząc skórę i wkładając końcówkę igły.
7. Potwierdź odpowiedni poziom znieczulenia, wykonując uszczypnięcie palca u nogi i obserwując brak ruchu. Ponadto monitoruj tętno, aby upewnić się, że mieści się w normalnych wartościach (od 300 do 400 uderzeń/min).
8. Naciąć skórę głowy w linii prostej wzdłuż mediany za pomocą ostrza skalpela #10, aby odsłonić zarówno szwy czołowe, jak i strzałkowe.
9. Odsłoń punkty Lambda i Bregma, odsuwając na bok tkankę pokrywającą czaszkę za pomocą szpatułki chirurgicznej.
10. Wypoziomuj czaszkę tak, aby pozycje Bregma i Lambda znajdowały się na tej samej płaszczyźnie.
11. Aby ustawić punkt odniesienia, użyj urządzenia stereotaktycznego z zamontowaną szklaną rurką, aby ustawić go tuż nad Bregmą. Będzie to "zero" dla współrzędnych pomiarów przednio-tylnych i przyśrodkowo-bocznych.
12. Ustaw punkt zainteresowania, przesuwając montaż stereotaktyczny do wymaganych współrzędnych, zanotuj współrzędne stereotaktyczne i narysuj kwadrat wokół obszaru docelowego, który oznacza miejsce, w którym zostanie wykonana kraniotomia.
13. Użyj wiertła chirurgicznego ze wysterylizowanym wiertłem wzdłuż zaznaczonego kwadratu powoli bez nacisku, aby powoli usunąć materiał kostny. Uważaj, aby nie wiercić zbyt długo w tym samym obszarze, ponieważ spowoduje to wytwarzanie ciepła i spowodowanie zmian w korze.
14. Gdy kość ograniczająca kraniotomię stanie się wystarczająco cienka, ostrożnie usuń część czaszki pęsetą, aby odsłonić korę.
15. Często przepłukuj odsłoniętą korę sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym, aby zapobiec wysuszeniu tkanek.
    UWAGA: Usuwanie opony twardej nie jest konieczne u szczura, ponieważ końcówka iniekcji jest wystarczająco mocna, aby przeniknąć.

3. Napełnianie i montaż układu iniekcyjnego

1. Napełnij mikrostrzykawkę o pojemności 5-10 μl poprzez zasysanie olejem mineralnym.
2. Napełnij igłę podskórną stałą szklaną pipetą roztworem 0,5% Chicago Sky Blue (CSB) i 300 μM kwasu γ-aminomasłowego (GABA) lub roztworem 2% lidokainy z 0,5% CSB. Rozcieńczyć wszystkie roztwory solą fizjologiczną.
   1. W przypadku obfitej substancji, napełnij ją zwykłą strzykawką i zastosuj zwykłe techniki ostrożności, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza.
   2. W przypadku droższych substancji, do napełnienia wtryskiwacza należy użyć oleju mineralnego, a następnie można wprowadzić środek chemiczny przez aspirację. Ponieważ różnica gęstości między olejem mineralnym a wodą jest stosunkowo duża, substancja ta jest dobrym kandydatem do wstrzykiwania roztworów wodnych.
      UWAGA: Można dodać barwnik, aby potwierdzić separację między dwiema cieczami.
3. Aby napełnić pipetę do wstrzykiwań, należy napełnić strzykawkę o pojemności 1 ml roztworem przez aspirację, a następnie powoli wstrzyknąć roztwór do pipety iniekcyjnej.
4. Zwrócić szczególną uwagę na nieszczelności w obszarach wskazanych na rysunku 1, pobierając wymaz z tych obszarów do czysta i obserwując wycieki, dalej powoli wstrzykując roztwór za pomocą strzykawki.
5. Wyjąć strzykawkę o pojemności 1 ml. Należy przy tym lekko naciskać na tłok, aby podciśnienie nie usunęło roztworu z pipety iniekcyjnej.
6. Napełnić mikrostrzykawkę olejem mineralnym przez aspirację i mocno przymocować ją do napełnionej pipety iniekcyjnej, a następnie ostrożnie zetrzeć gazą nadmiar roztworu ze zmontowanej iniekcji.
7. Sprawdzić, czy końcówka nie jest zablokowana, wstrzykując bardzo małą objętość, wystarczającą do zobaczenia małej kropli tworzącej się na końcówce szklanej pipety.
8. Zamontuj wtryskiwacz w układzie mikropompy i upewnij się, że jest dobrze zamocowany.
9. Ostrożnie ustaw końcówkę wtrysku na współrzędnych docelowych i opuść końcówkę na powierzchnię kory.
10. Powoli opuścić iniekcję za pomocą aparatu stereotaktycznego do struktury docelowej (w tym przypadku wzgórka górnego) za pomocą odpowiednich współrzędnych anatomicznych.
11. Przykryj odsłoniętą korę ciepłym agarem, aby zapobiec wysuszeniu tkanek.

4. Wtrysk i odwracalna inaktywacja Ustaw

1. pompę mikroiniekcji tak, aby wstrzykiwała od 400 do 800 nl przy 40 nl/min i naciśnij Uruchom, aby rozpocząć wtrysk. Należy pamiętać, że szybkość skoku wykaże zmniejszenie podczas wstrzyknięcia.
   UWAGA: W konfiguracji eksperymentalnej aktywność neuronalna odzyskała się w ciągu godziny po zakończeniu dostarczania GABA. Każde skalibrowane urządzenie mechaniczne może być użyte do wywierania nacisku na strzykawkę do mikroiniekcji w celu przeprowadzenia wstrzyknięcia.
2. Po uzyskaniu danych elektrofizjologicznych należy poddać się eutanazji przy użyciu metody zatwierdzonej przez lokalną Komisję Etyki Zwierząt.

Wyniki

Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie zespołu wtryskiwacza. Mikrostrzykawka (A) jest dołączona do pipety rejestrująco-iniekcyjnej, która składa się z igły podskórnej o sile 30 G (B) przyklejonej do srebrnego ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pompa wtryskowa (UltraMicroPump III)	WPI
Konsola wtryskowa (kontroler Micro4)	Strzykawka WPI	#SYS-MICRO4
Hamilton	Hamliton	(80301) 701LT 10 μL SYR	Używane strzykawki o pojemności od 5 do 10 μl
Żelowy klej cyjanoakrylowy	Krazy Glue	KG86648R	Forma żelu jest łatwiejsza do nałożenia na trzon igły podskórnej 30G
Pipety szklane	WPI	#TW100F-4	Cienkościenne, 1 mm OD, 0,75 mm ID z używanymi pipetami filamentowymi
720 Ściągacz do pipet igłowych	Kopf	720
Srebrny drut	AM Systems, Inc.	782500	Gołe 0,010"

#UMP3