Subpialne dostarczanie genów w rdzeniu kręgowym myszy w celu oceny ekspresji genów

Streszczenie

Źródło: Tadokoro, T., et al. Dostarczanie wektorów subpialnego wirusa Adeno-associated 9 (AAV9) u dorosłych myszy. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film przedstawia technikę iniekcji podskórnej w celu dostarczenia genu do rdzenia kręgowego u myszy. Procedura polega na odsłonięciu opony twardej, nakłuciu opony twardej i wstrzyknięciu rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem (rAAV) przenoszącego gen eksprymujący białko fluorescencyjne do przestrzeni subpialnej. Po wstrzyknięciu i rekonwalescencji wirus ułatwia ekspresję genów w komórkach rdzenia kręgowego, umożliwiając badanie ekspresji genów docelowych.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Ogólne przygotowanie zwierząt i chirurgiczne

1. Przed rozpoczęciem zabiegu chirurgicznego należy rozmrozić wirusa (AAV9-UBI-GFP [UBI: Ubiquitin Promoter, GFP: Green Fluorescent Protein]; 5 μL podwielokrotności). Przygotuj 5% roztwór dekstranu (10 000 MW), mieszając proszek dekstranu z wodą destylowaną. Roztwór wirusa zmieszać z 5% roztworem dekstranu w stosunku 1:1, aby uzyskać końcowe stężenie dekstranu 2,5%.
   1. Roztwór wirusa należy przechowywać na lodzie (4 °C).
2. Użyj dorosłych myszy C57BL/6J (samce i samice, 20-30 g). Znieczulenie myszy za pomocą 5% izofluranu (w O₂, 1 l / min) i utrzymywanie ich na poziomie 2-3% wdychanego izofluranu (w O₂, 1 l / min) przez stożek nosowy podczas operacji, w zależności od częstości oddechów i reakcji na uszczypnięcie łapy.
3. Ogol grzbiet zwierząt maszynką do golenia i oczyść skórę 2% chlorheksydyną.
4. W badaniach nad przewlekłym odzyskiwaniem należy przestrzegać ścisłej sterylnej techniki.
5. Jeśli mają być wykonane iniekcje podbrzuszne lędźwiowe, należy przeciąć skalpelem skórę pokrywającą kręgi Th8-L1 i odłączyć mięsień przykręgosłupowy od kręgów kręgowych Th10-12 za pomocą nożyczek.
   1. Zamontuj zwierzę w standardowej ramie stereotaktycznej za pomocą mysich zacisków kręgosłupa.
   2. Ogol obie strony blaszki kręgów Th10-12 za pomocą wiertła dentystycznego (wiertło: 0,9 mm, prędkość: 20 000 obr./min), aż pojawią się pęknięcia.
   3. Usuń popękane fragmenty kości za pomocą kleszczy i odsłoń grzbietową powierzchnię lędźwiowego rdzenia kręgowego.
   4. Rozciąć oponę twardą na około 1 cm za pomocą igły ze stali nierdzewnej 30 G i kleszczyków.

2. Otwieranie membrany Pial i wkładanie igły podskórnej w celu dostarczenia AAV9

1. Zamontuj igłę penetrującą pia 34 G w ramieniu Z manipulatora XYZ za pomocą szklanego uchwytu kapilarnego (Rysunek 1A i B).
   UWAGA: Aby wyprodukować igłę penetrującą pia, oryginalna skośna końcówka igły 34G jest ostrzona za pomocą szklanej ukosowarki kapilarnej z diamentową płytką ścierną - grubą (końcówka od 5,0 μm do 50 μm rozmiary) i kąt szlifowania 15 - 20°. Końcówka igły (długość 1 mm, mierzona od końcówki) jest następnie delikatnie wyginana pod kątem około 90° (Rysunek 1B, lewa wkładka).
2. Używając chirurgicznej lunety preparacyjnej ustawionej na powiększenie 8-10X, przebij pia igłą penetrującą pia o około 1 mm (ryc. 1C) za pomocą ramienia X.
   1. Utrzymuj kąt wbijania igły do powierzchni tkanki na poziomie 5-10°.
3. Po otwarciu pia wyjmij igłę penetrującą pia poziomo z przestrzeni podbrzusznej (Rysunek 1D) za pomocą ramienia X.
   UWAGA: Zapamiętaj miejsce, w którym znajduje się punkt orientacyjny, taki jak naczynie krwionośne.
4. Załadować igłę do wstrzykiwań 36G z wirusem AAV9-UBI-GFP za pomocą mikrostrzykawki o pojemności 50 μl połączonej z igłą do wstrzykiwań za pomocą rurki PE-10 lub PE-20.
5. Zamontuj igłę w ramieniu Z drugiego manipulatora XYZ (Rysunek 1A i B) za pomocą szklanego uchwytu kapilarnego (Rysunek 1B, prawa wkładka).
   UWAGA: Aby wyprodukować igłę do iniekcji subpial AAV9, końcówka igły 36 G jest polerowana za pomocą szklanego ukosowania kapilarnego z diamentową płytką ścierną - grubą (rozmiary końcówek od 5,0 μm do 50 μm) w celu usunięcia ostrych krawędzi. Końcówka igły (długość 2-3 mm, mierzona od końcówki) jest następnie delikatnie wyginana pod kątem około 90°. Igły iniekcyjne penetrujące pia i podskórne są wkładane do rurki ze stali nierdzewnej o długości 1-2 cm (10 mm od końca igły) i sklejane żywicą epoksydową. Do bezpiecznego zamocowania do szklanego uchwytu kapilarnego wymagane jest użycie rurki o średnicy 20 G (0,91 mm).
6. Manipulując ramionami X, Y i Z drugiego manipulatora, umieść końcówkę igły do wstrzykiwań AAV9 w miejscu penetracji pia, a następnie wsuń ją o około 2-3 mm w przestrzeń podskórną przez poprzedni otwór błony pial za pomocą ramienia X (Rysunek 1E i F).
   UWAGA: 1) AAV9-UBI-GFP jest przygotowywany zgodnie z wcześniej zgłoszonymi protokołami, a końcowe miana są dostosowywane do 1,2 x 10¹³ kopii genomu na ml (gc / ml). 2) Nie ma potrzeby oznaczania miejsca otworu hydraulicznego, ponieważ jest on łatwy do zidentyfikowania (rysunek 1D).
7. Wstrzyknąć AAV9-UBI-GFP (1,5, 3 lub 5 μL) do przestrzeni subpialnej za pomocą mikrostrzykawki o pojemności 50 μl (patrz Tabela 1 dla grup eksperymentalnych).
8. Wyjąć igłę do wstrzykiwań z przestrzeni podbrzusznej po zakończeniu wstrzykiwania AAV9-UBI-GFP.
9. Zamknij mięsień i skórę za pomocą nici monofilamentowej 4.0 i klipsów chirurgicznych.
   UWAGA: Nie ma potrzeby uszczelniania otwartego kręgu.
10. Pozwól zwierzętom dojść do siebie na poduszce grzewczej.
11. W celu opanowania bólu należy wstrzykiwać buprenorfinę w dawce 0,05 mg/kg/mc. co 12 godzin przez 2-3 dni po zabiegu.

Tabela 1: Grupy eksperymentalne. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono na dorosłych myszach C57BL/6J.

Grupy eksperymentalne	Miejsce/poziom dostarczenia AAV9 (*)	Objętość AAV9 inj, szybkość infuzji	Czas przeżycia	Analiza tkankowa
Grupa A (n = 7)	C2 (obustronna)	5 μL/5 min	14 dni	Mózg + rdzeń kręgowy
Grupa B (n = 12)	L1-L2 (obustronna)	1,5 μL lub 3 μL, 60 s/μL	14 dni	Mózg + rdzeń kręgowy
Grupa C (n = 6)	C2 + L1-L2 (obustronne na każdym poziomie)	5 μL/5 min	14 dni	Rdzeń kręgowy
* - obustronne = wykonuje się dwa wstrzyknięcia podskórne, jedno dostarczane do prawej, a drugie do lewej przestrzeni podskórnej wstrzykniętego segmentu (segmentów).

Wyniki

Rysunek 1: Eksperymentalna konfiguracja do wykonywania iniekcji podrdzeniowych u dorosłej myszy. (A) Do wykonywania podrdzeniowych iniekcji podrdzeniowych u dorosłych myszy stosuje się dwa oddzielne manipulat...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
C57BL/6J Myszy	Jackson Labs	664
Lab Standard stereotaktyczny dla myszy	Aparat Harvard	72-9568
Adaptor kręgosłupa myszy	Aparat Harvard	72-4811
XYZ Manipulator	Stoelting	51604
Ręczna pompa infuzyjna	Stoelting	51218
34G Skośna igła Nanofill	Precision Instruments	NF34BV-2
36G igła do nanowypełnienia	World Precision Instruments	NF-36BL-2
Fluriso, Isoflurane	MWI Veterinary Supply	502017
Roztwór chlorheksydyny	MWI Veterinary Supply	501027
Igła ze stali nierdzewnej 20G	Becton-Dickinson	305175
23G	Becton-Dickinson	305145
	MWI Veterinary Supply	27426
Szklana ukosowarka kapilarna	Narishige International	SM-25B
Mikroskop szkiełkowy Superfrost	Leica Microsystems	M80
50μl Mikrostrzykawka	Hamilton	81242
BD Rurka Intramedic PE-20	Becton, Dickinson	427406
BD Rurka Intramedic PE-10	Becton, Dickinson	427401
4-0 szew monofilamentowy	VetOne	V1D397
Szklana ukosowarka kapilarna	Narishige	Pipet Micro Grinder EG-40
5 min Żywica epoksydowa (bezbarwna żywica epoksydowa)	Devcon	14310
Dextran	Polysciences, Inc	19411
AAV9-UBC-GFP	Laboratorium Rdzenia Wektorów Wirusowych UCSD

World Igła ze stali nierdzewnej Igła ze stali nierdzewnej 30G Aplikator z bawełnianą końcówką Becton-Dickinson 305128