Monitorowanie ekspresji genów w czasie rzeczywistym w wycinkach mózgu za pomocą obrazowania trójwymiarowego

Streszczenie

Źródło: Shimojo, H., et al. Obrazowanie bioluminescencyjne w czasie rzeczywistym dynamiki sygnalizacji Notch podczas neurogenezy myszy. J. Vis. Exp. (2019 rok)

W tym filmie kultury warstw korowych z transgenicznych zarodków myszy są wykorzystywane do monitorowania ekspresji genów za pomocą obrazowania trójwymiarowego. Obrazy bioluminescencji, fluorescencji i jasnego pola są wykorzystywane do wizualizacji ekspresji genów w czasie rzeczywistym podczas różnicowania neuronów w tkance natywnej.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Wizualizacja ekspresji reportera lucyferazy w kulturach warstwowych
   1. Uruchom system obrazowania luminescencji na żywo przed rozpoczęciem sekcji. Dla kultur warstw korowych należy stosować następujące warunki: 40% O₂ , 5 % CO₂ i 37 °C.
   2. Nałóż olejek immersyjny na soczewkę obiektywu 40x. Umieść naczynie na próbkę na stoliku mikroskopu. Uzyskaj fluorescencyjny obraz testowy i ustaw pozycję i płaszczyznę ostrości na obszar zainteresowania w oświetleniu światłem wzbudzającym.
   3. Uruchom akwizycję poklatkową za pomocą akwizycji trójwymiarowych (luminescencja, fluorescencja i jasne pole) przez 24 godziny (rysunek 1F-H). Do akwizycji obrazu luminescencyjnego należy użyć następujących ustawień aparatu: niska szybkość przesyłania (50 kHz), binning 2x2/4x4, czas naświetlania 10 min/5 min. Do akwizycji obrazu fluorescencji i jasnego pola użyj następujących ustawień: pośrednia szybkość przesyłania (1 MHz), binning 1x1 i czas naświetlania 100 ms.

Wyniki

Rysunek 1: Tworzenie wycinków korowych embrionalnego kresomózgowia i wizualizacja dynamiki białka Dll1 w kulturach warstw korowych. (A) Sprawdzenie ekspresji EGFP za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego. Czerwona strzałka pokaz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Cyrkulator wody lodowej (chiller)	Julabo	Model: F12-ED
Chłodzona kamera CCD	Andor Technology	Model: iKon-M 934
System inkubatora	TOKAI HIT	Model: INU-ONICS
Mikroskop odwrócony	Olympus	Modelu: IX81
Mikroskop odwrócony	Olympus	Model: IX83
Urządzenie oświetleniowe LED	CoolLED	Model: pE1
MetaMorph	URZĄDZENIA MOLEKULARNE	Model: 40000
Kontroler gazu mieszającego	Tokken	Model: TK-MIGM OLO2
Soczewka obiektywowa	Olympus	Model: UPLFLN 40X O