Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Wstrzykiwanie czynników przeprogramowujących do
- układu Brain Animal, stereotaktyczne umieszczanie i wiercenieUWAGA: Ten protokół koncentruje się na wykorzystaniu Ascl1, Lmx1a i Nurr1 (ALN) do przeprogramowania gleju NG2 (Neuron-Glial Antigen 2) do interneuronów. Z naszego doświadczenia wynika, że interneurony o podobnym fenotypie można uzyskać przy użyciu innych kombinacji czynników
- Przesuń ramię M/L-D/V ramy stereotaktycznej na miejsce (nad zwierzęciem) i zabezpiecz je.
UWAGA: Ramka stereotaktyczna umożliwia regulację strzykawki wzdłuż osi przedniej/tylnej (A/P, Y), przyśrodkowej/bocznej (M/L, oś X), i oś grzbietowa/brzuszna (oś D/V, Z). - Przesuń strzykawkę wzdłuż różnych osi ramy stereotaktycznej, aby końcówka szklanej kapilary znalazła się tuż nad bregmą (punktem połączenia, w którym spotykają się różne płytki czaszki).
- Upewnij się, że końcówka kapilarna jest idealnie prosta zarówno w płaszczyźnie A/P, jak i M/L. W przypadku niejednoznacznej bregmy należy wziąć średnią ze szwów bocznych i środkowych.
- Gdy końcówka kapilary zostanie prawidłowo umieszczona nad bregmą, zresetuj zarówno wartości M/L, jak i A/P do 0,0 na cyfrowym liczniku współrzędnych.
- Aby upewnić się, że głowa zwierzęcia znajduje się w idealnie płaskiej pozycji, użyj cyfrowego licznika współrzędnych do zmierzenia wartości współrzędnych D/V, gdy ramię A/P znajduje się na poziomie +2,0 i -2,0 (M/L = 0,0), a także gdy ramię M/L znajduje się na poziomie +2,0 i -2,0 (A/P = 0,0). Dostosuj odpowiednio wysokość listwy zębatej i nauszników.
- Przesunąć strzykawkę do żądanych współrzędnych w celu wstrzyknięcia wektorów wirusowych w prążkowiu (A/P = +1,0; M/L = -2,0, w stosunku do bregmy).
- Lekko unieść strzykawkę i patrząc na miejsce wstrzyknięcia przez mikroskop, wywiercić otwór za pomocą wiertła dentystycznego we współrzędnych wstrzyknięcia. Rozpocznij wiercenie w miejscu, pracując okrężnie i delikatnie.
UWAGA: Nie naciskaj zbyt mocno w dół, ponieważ wiertło powinno być wystarczająco ostre, aby przejść przez kość bez dodatkowej siły. Unikaj długiego, długotrwałego wiercenia, ponieważ powoduje to wytwarzanie ciepła. - Pod koniec wiercenia sprawdzić, czy opona twarda pozostaje nienaruszona i odsłonięta do wstrzyknięcia.
- Przygotowanie do ustawienia strzykawki
- Umieść kawałek bawełnianej gazy na otwartym nacięciu i przepłucz strzykawkę roztworem soli fizjologicznej.
- Po przepłukaniu należy pobrać pęcherzyk powietrza o objętości 1–2 μl, a następnie 1 μl roztworu zawierającego wektory wirusowe, unikając niezamierzonych pęcherzyków. Upewnij się, że roztwór wirusowy można łatwo uwidocznić poniżej pęcherzyka powietrza podczas wstrzykiwania.
- Wstrzyknięcie wirusa
- Usuń bawełnianą gazę z miejsca nacięcia i opuść strzykawkę za pomocą ramienia D/V ramy stereotaktycznej. W miarę zbliżania się do powierzchni czaszki uważnie spójrz przez mikroskop i zmierz poziom D/V opony twardej - powinna się lekko wybrzuszyć pod delikatnym naciskiem.
- Dotykając opony twardej końcówką kapilary, ustaw współrzędną D/V na 0,0.
- Opuścić strzykawkę, powoli przesuwając się do żądanej głębokości (D/V = -2,7, w stosunku do opony twardej). Upewnij się, że trajektoria jest wolna od fragmentów kości, tak aby nie zaobserwowano zgięcia igły/kapilary.
UWAGA: Przedstawione współrzędne odnoszą się do wstrzyknięcia czynników przeprogramowujących do prążkowia myszy NG2-Cre. Można użyć współrzędnych odpowiadających innym obszarom mózgu. Zawsze najpierw przetestuj współrzędne do wstrzyknięcia za pomocą barwnika (np. Trypan Blue), kolorowego zastrzyku kulki lub reporterowego wektora wirusowego przed wstrzyknięciem czynników przeprogramowujących do mózgu nowego szczepu myszy. W przypadku wstrzyknięcia błękitu trypanowego zwierzęta muszą zostać uśmiercone natychmiast po operacji, a mózg wycięty. Świeże mózgi można wyciąć za pomocą mikrotomu, podczas gdy są zamrożone, a miejsce wstrzyknięcia można określić na podstawie wizualizacji położenia barwnika w mózgu. Jeśli współrzędne testuje się za pomocą kolorowych kulek, możliwe jest określenie miejsca wstrzyknięcia na perfundowanych i pociętych mózgach tydzień po wstrzyknięciu. Alternatywnie można zastosować wstrzyknięcie wektora wirusowego przenoszącego gen reporterowy, a miejsce wstrzyknięcia określić w perfundowanych naciętych mózgach. - Wstrzyknąć 1 μl roztworu wirusa z szybkością 0,4 μl/min. Po wstrzyknięciu całej objętości należy odczekać 2 minuty dyfuzji przed pobraniem strzykawki.
- Po dyfuzji powoli wycofaj strzykawkę, aż końcówka naczynia włosowatego całkowicie wystanie z mózgu.
- Umieść kawałek bawełnianej gazy na ranie i przepłucz strzykawkę roztworem soli fizjologicznej.
- Przesuń ramię M/L-D/V ramy stereotaktycznej poza obszar roboczy.
- Zamykanie ran i zabiegi pooperacyjne
- Ostrożnie zszyj nacięcie za pomocą nici do szwów.
UWAGA: Wszystkie nici do szycia stosowane u zwierząt, którym wstrzyknięto zastrzyki, powinny być wyrzucone do kubka/fiolki zawierającej przeciwwirusowy roztwór detergentu. To samo rozwiązanie stosuje się do czyszczenia wszystkich powierzchni otaczających obszar operacyjny, które miały kontakt z materiałami chirurgicznymi. Wszystkie narzędzia chirurgiczne są dokładnie myte i sterylizowane w autoklawie pod koniec każdego dnia operacji. - Wyjmij zwierzę z ramy stereotaktycznej i umieść je w stacji pooperacyjnej, która obejmuje czystą, podgrzewaną klatkę, dostęp do jedzenia i wody oraz miejsce, w którym zwierzę pozostaje do momentu pełnego wybudzenia. W tym okresie należy uważnie obserwować zwierzę, aż do odzyskania przytomności.
- Nie należy trzymać operowanych zwierząt ze zwierzętami nieoperowanymi, dopóki te pierwsze nie wyzdrowieją w pełni po operacji.
- Codziennie nadzoruj operowane zwierzęta. W zależności od zastosowanych szwów upewnij się, że zostały one usunięte w razie potrzeby. Wszystkim zwierzętom podawano podskórnie Bupenorphinum (Temgesic w dawce 1 ml/kg) jako opiekę pooperacyjną.
UWAGA: W przypadku pracy przy użyciu tej samej strzykawki przez dwa kolejne dni, przepłukać ją wodą, a następnie etanolem 70% i ponownie wodą. Pozostawić strzykawkę wypełnioną wodą na noc, aby umożliwić rozpuszczenie wszelkich ewentualnych pozostałości.