$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Chirurgia/kraniotomia
- Zamocuj głowę znieczulonej myszy w stereotaktycznej ramce. Za pomocą igły 30 G wstrzyknąć miejscowo przeciwbólową ropiwakainę (5 μl, 7,5 mg/ml, patrz tabela materiałów) podskórnie w planowane miejsce nacięcia. Odczekaj 5 minut, aż zacznie działać.
- Wykonaj skalpelem prostą linię środkową w skórze nad czaszką. Delikatnie pociągnij skórę na boki za pomocą cienkich kleszczy i zaciśnij ją na bok za pomocą zacisków bulldog serrefine, aby czaszka była odsłonięta do dalszej pracy.
- Oczyść czaszkę z powięzi skalpelem lub innym podobnym narzędziem. W przypadku powierzchownego krwawienia należy usunąć krew wacikami lub małymi kawałkami ręcznika papierowego.
- Weź uziemiającą pokrytą poli(3,4-etylenodioksytiofenem) sulfonianem polistyrenu (PEDOT: PSS) (rozmiar: #00, średnica: 0,047 cala, długość: 1/8 cala, patrz tabela materiałów) z lutowanym przewodem i podłącz go za pomocą złącza do amplifier headstage.
- Zwilż czaszkę w żądanym miejscu otworu i wywierć otwór z dużą prędkością za pomocą drobnego, okrągłego wiertła (o średnicy 0,4 mm) w czaszce nad móżdżkiem, aż opona twarda będzie widoczna. Włóż uziemiającą do otworu i wkręć ją precyzyjnym śrubokrętem, aż dotrze do górnej części móżdżku.
UWAGA: Śruba z została pokryta zanurzeniowo roztworem PEDOT:PSS zawierającym wagowo 1% 3-glicydyloksypropylo)trimetoksysilanu (GOPS), a następnie wypiekana w temperaturze 140 °C przez 90 min. PEDOT:PSS jest sprzężonym polimerem o pojemności wolumetrycznej, o której wiadomo, że jest biokompatybilna. GOPS jest środkiem sieciującym zmieszanym z PEDOT:PSS w celu zwiększenia stabilności w środowisku wodnym (rysunek 1). - Za pomocą ramki stereotaktycznej zmierz współrzędne stereotaktyczne dla żądanego obszaru mózgu. Na przykład obszarem zainteresowania jest hipokamp, przednio-tylny (AP) -1,8 mm i przyśrodkowo-boczny (ML) 1,8 mm od punktu Bregma na podstawie atlasu mózgu dla myszy.
UWAGA: Są to współrzędne prawej półkuli (ryc. 1). - Rozcieńczyć obszar czaszki o średnicy około 1 do 2 mm powyżej obszaru docelowego za pomocą niezawodnego wiertła dentystycznego (patrz Tabela materiałów) ustawionego z dużą prędkością, aż pozostanie cienka, dobrze wypolerowana, przezroczysta błona kostna.
- Następnie, jeśli grubość błony kostnej jest wystarczająco cienka (<200 μm), wykonaj mały otwór cienkimi kleszczami i delikatnie usuń cienką warstwę kości. Użyj specjalnie wykonanej igły z haczykowatą końcówką, aby usunąć oponę twardą. Zminimalizuj rozmiar kraniotomii i durotomii, aby zapobiec rozwojowi obrzęków i zminimalizować pulsacje serca i/lub oddechu mózgu.
UWAGA: Kraniotomia musi być wypełniona kroplą roztworu soli fizjologicznej, aby zapobiec wysuszeniu, a następnie regularnie uzupełniana podczas eksperymentu (ryc. 1).
2. Wprowadzenie wielokanałowej sondy krzemowej
- Użyj ramion stereotaktycznych pod niewielkim kątem AP (20 °), aby sonda krzemowa pozostawiła wystarczająco dużo miejsca na ustawienie pozostałych dwóch implantów i aby miejsca rejestracji i wstrzyknięcia elektrody, pompy jonowej i mikropipety były jak najbliżej siebie.
UWAGA: Elektrody, strzykawki i pompy jonowe pokryto kroplą roztworu barwienia DiI (nadchloran 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetrametyloindokarbocyjaniny [DiI]) w celu wizualizacji post hoc śladów implantacji (0,5 mg/ml DiI w dimetylosulfotlenku). - Umieść sondę silikonową na ramieniu stereotaktycznym przymocowanym do uchwytu magnetycznego i umieść ją obok ramy stereotaktycznej. Ustaw kąt AP (20°), a następnie podłącz sondę do headstage i do uziemiającej.
- Powoli opuść sondę krzemową do hipokampa za pomocą ramienia stereotaktycznego z precyzją mikronów lub zmotoryzowanego mikromanipulatora, aby uniknąć ruchów bocznych (Rysunek 1 i Rysunek 2).
- Uruchom oprogramowanie do nagrywania i nagrywaj - za pomocą headstage, podłączonego wzmacniacza i komputera - elektryczne sygnały neuronalne, przesuwając wielokanałową sondę krzemową od szczytu kory mózgowej, aż do osiągnięcia docelowej pozycji grzbietowo-brzusznej (DV) (-1,800 μm od powierzchni kory). Nagrywaj i obserwuj sygnał potencjału pola lokalnego (LFP) podczas penetracji na ekranie komputera.
UWAGA: Kontroluj opadanie sondy tak, aby poruszała się powoli i nieprzerwanie podczas nagrywania, aby mieć lepszą kontrolę wizualną nad penetracją i dotarciem do strefy docelowej. - Wykorzystaj aktywność tętnień w warstwie piramidalnej formacji hipokampa w zarejestrowanym LFP jako marker strefy docelowej.
UWAGA: Aktywność tętnień jest widoczna na jednym lub dwóch sąsiednich kanałach wielokanałowej sondy krzemowej (Si) o odległości 100 μm między miejscami rejestracji (Rysunek 3). - Rejestruj sygnały LFP z warstw kory mózgowej i hipokampa jednocześnie przez oprogramowanie wzmacniacza wielokanałowego (patrz tabela materiałów) za pomocą wielokanałowych sond Si (ryc. 3).
3. Wprowadzenie mikroprzepływowej pompy jonowej (μFIP)
- Podłącz rurki (patrz tabela materiałów) do wlotu μFIP i napełnij sondę 0,05 M roztworem kwasu gamma-aminomasłowego (GABA). Wyjmij rurki i zamknij wlot folią parafinową. Podłącz przewody elektryczne do źródłowej jednostki pomiarowej.
- Włóż μFIP za pomocą ramienia stereotaktycznego pod kątem przyśrodkowo-bocznym (MP) (20°). Sonda Si pozostaje włożona podczas całego procesu.
UWAGA: μFIP jest bardzo elastyczny i może skorzystać z pomocy małego i czystego pędzla, aby utrzymać go prosto, dopóki nie dotrze do powierzchni mózgu. Po tym kroku μFIP można delikatnie opuścić ruchami osiowymi. - Obniżaj μFIP powoli ruchami osiowymi i nigdy nie pozwól mu się zginać podczas trajektorii, dopóki nie osiągnie współrzędnej grzbietowo-brzusznej (DV) (-1,200 μm od powierzchni kory).
UWAGA: Spróbuj umieścić oba urządzenia (μFIP i sondę krzemową) jak najbliżej siebie, biorąc pod uwagę odległość wylotu μFIP wynoszącą 300 μm.
UWAGA: Unikaj wszelkich problemów mechanicznych między urządzeniami i ich złączami podczas wkładania (Rysunek 1B i Rysunek 2B).
4. Przygotowanie urządzeń do indukcji napadów padaczkowych
- Wymienić metalową igłę strzykawki (10 μl) (patrz tabela materiałów). Wyjąć metalową część przytrzymującą igłę, umieścić i zamocować mikropipetę (średnica zewnętrzna [OD]: 1,2 mm, średnica wewnętrzna [ID]: 0,75 mm, średnica końcówki: 20–50 μm przy ± 0,5 cm zwężenia trzonka), a następnie wymienić element mocujący igłę.
- Ustawić strzykawkę i dołączoną mikropipetę borokrzemianową pod kątem 20° boczno-przyśrodkowym (LM) do wstrzyknięcia 4-aminopirydyny (4AP) (50 mM w sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym [ACSF]).
UWAGA: Nie używać metalowej igły strzykawki ani mikropipety z końcówką większą niż 50 μm. - Pobierz 500 nL–1 μL z 50 mM 4AP za pomocą automatycznej pompy do mikroiniekcji.
5. Wprowadzenie szklanej pipety dołączonej do strzykawki do wstrzykiwania 4AP
- Opuścić szklaną mikropipetę dołączoną do strzykawki do wyznaczonej pozycji DV (-1 500 μm), a następnie wstrzyknąć 250 nL roztworu 4AP (Rysunek 1 i Rysunek 2). Rozpocznij nagrywanie za pomocą oprogramowania do nagrywania. Obserwuj ekran i poczekaj, aż pojawi się pierwszy skok międzynapadowy.
- Rozpocznij dostarczanie GABA za pomocą μFIP natychmiast po pojawieniu się pierwszego kolca międzynapadowego. Dostarczyć GABA, przykładając 1 V między źródłem a celem przez 100 s, a następnie 1 s off przez 30 cykli. Za pomocą oprogramowania rejestrującego nagrywaj przez co najmniej 2 godziny < br />UWAGA: Całkowita masa dostarczonego GABA wynosi około 1 nmol (rysunek 4).
- Pod koniec eksperymentu delikatnie wyjmij włożone sondy i uziemiającą, a następnie wyjmij zwierzę ze sprzętu stereotaktycznego. Zwierzęta zostały poddane eutanazji przy użyciu przedawkowania narkotyków (i.p.100mg/kg pentobarbitalu). Zgon został potwierdzony przez zatrzymanie oddechu i krążenia.
