Wizualizacja sieci nerwowych i naczyniowych w zarodku kurczaka

W tym artykule

Streszczenie

Źródło: Delalande, J., et.al. Podwójne znakowanie komórek grzebienia nerwowego i naczyń krwionośnych w zarodkach kurczaków za pomocą szczepienia cewy nerwowej^{piskląt GFP} i wstrzyknięcia barwnika karbocyjaninowego DiI. J. Vis. Exp. (2015)

Ten film pokazuje przeszczepienie cewy nerwowej dawcy znakowanej GFP z dopasowanego etapu transgenicznego zarodka kurczaka do zarodka biorcy na poziomie somitów od jednego do siedmiu, a następnie znakowanie naczyniowe przy użyciu lipofilowego barwnika fluorescencyjnego. Podejście łączone pozwala na bezpośrednią wizualizację zarodka pod mikroskopem stereofluorescencyjnym, umożliwiając badanie integracji przeszczepów nerwowych i rozwoju sieci naczyniowej u ow.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przeszczepić tkankę

Za pomocą szklanej mikropipety ostrożnie przenieś wypreparowaną rurkę nerwową ze szkła zegarka do zarodka gospodarza. Ustaw cewę nerwową w prawidłowej orientacji przednio-tylnej i delikatnie popchnij eksplant przylegający do wyciętego obszaru gospodarza pisklęcia za pomocą mikroskalpela. Pozostaw mały fragment ektodermy przyczepiony do powierzchni grzbietowej lub wycinając małe nacięcie w niej, aby określić orientację cewy nerwowej.
1. Jeśli to konieczne, użyj mikroskalpela, aby przyciąć eksplantat do dokładnego rozmiaru wyciętego obszaru.
Delikatnie wprowadź cewę nerwową do obszaru ablacji i ustaw ją tak, aby strona grzbietowa była prawidłowo zorientowana. Użyj szklanej mikropipety, zamontowanej na rurki ustnej, aby usunąć PBS i/lub płyn otaczający przeszczep. Pomaga to w przyleganiu tkanek dawcy i gospodarza oraz w ustabilizowaniu się przeszczepu.
Uszczelnij całe okno przezroczystą taśmą o szerokości 24 mm, aby zapobiec odwodnieniu i zanieczyszczeniu.
Oznacz chimeryczny zarodek, zaznaczając ołówkiem na skorupce jajka i zapisz jego numer w książce laboratoryjnej. Zwróć jajo do inkubatora w celu dalszego rozwoju.

2. Wstrzyknij DiI do naczyń krwionośnych zarodka gospodarza

W pożądanym punkcie czasu eksperymentalnego (tutaj, 3 - 10 dni później) wyjmij chimeryczny zarodek z inkubatora i usuń przezroczystą taśmę za pomocą prostych nożyczek, aby uzyskać dostęp do zarodka w jaju.
W razie potrzeby powiększ okienko w skorupie za pomocą nożyczek. Należy uważać, aby nie uszkodzić błony kosmówkowo-omoczniowej, jeśli jest ona przyczepiona do muszli, co spowodowałoby krwotok i zagroziłoby oznakowaniu naczyń krwionośnych.
Wybierz dostępną żyłę na żółtku, upewniając się, że przepływ krwi jest skierowany w stronę zarodka. Wybierz punkt rozgałęzienia jednej z żył żółtkowych (ryc. 1B, C).
UWAGA: W E6.5 - E7.5 błona kosmówkowo-omoczniowa może wymagać delikatnego odsunięcia na bok pęsetą, aby uzyskać dostęp do żył żółtkowych. Po E8,5 jedyną opcją jest wstrzyknięcie do jednej z żył błony kosmówkowo-omoczniowej, ponieważ na tym etapie błona kosmówkowo-omoczniowa całkowicie pokrywa zarodek.
Usuń błonę witeliny powyżej wybranego punktu wstrzyknięcia za pomocą dwóch pęset Dumont #5, rozrywając w przeciwnych kierunkach.
Rozbij wyciągniętą szklaną igłę za pomocą Dumont #5 i dostosuj jej średnicę do przybliżonego rozmiaru żyły przed załadowaniem CellTracker CM-DiI. Przygotować roztwór podstawowy DiI o stężeniu 40 μg/μl w DMSO i przechowywać w temperaturze -20 °C. Przygotować roztwór roboczy w 0,3 M sacharozy/PBS o stężeniu 4 μg/μl.
1. Odessać od 5 do 10 μl DiI w 0,3 M sacharozy/PBS do igły, odsysając rurką ustną. Starsze zarodki mogą wymagać do 25 μl lub więcej. Od E8.5 zarodki mają większe, bardziej umięśnione żyły, które mogą wymagać utrzymania w pozycji za pomocą Dumont #5 przed dźgnięciem szklaną igłą obciążoną DiI.
Szybko włóż igłę do żyły i równomiernie rurką ustną, aby DiI powoli łączyło się z przepływem krwi bez tworzenia skrzepu. Alternatywnie użyj wtryskiwacza ciśnieniowego do dostarczania DiI.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1. Dożylne wstrzyknięcie DiI. (A) Zalecane instrumenty: a) kropla CellTracker CM-DiI na parafilm, b) ciągnięta szklana igła iniekcyjna, c) rurka do ust. (B) Schemat ideowy dożylnego wstrzyknięcia DiI do chimerycznego zar...